Molecular switches in CFTR processing and trafficking: the role of the novel interactor Rap1A

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A Fibrose Quística é a doença recessiva autossómica letal mais comum na população caucasiana. É caracterizada do ponto de vista clínico por um declínio rápido na função pulmonar, com obstrução das vias aéreas devido à ineficaz remoção de muco e consequentes infecções bacterianas recorrentes. Estas alterações estão associadas desde muito precocemente a um ambiente de hiperinflamação, que exacerba os processos de remodelação do tecido pulmonar e acaba por culminar na fibrose dos tecidos e perda da sua função. Além deste fenótipo respiratório, os pacientes apresentam ainda problemas digestivos graves, nomeadamente a nível pancreático, intestinal e hepático, e são inférteis no caso dos homens e de uma elevada percentagem das mulheres. A fibrose quística é causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que codifica para uma proteína com o mesmo nome. Neste momento, conhecem-se cerca de 1930 mutações causadoras da doença, sendo a mais comum a delecção de três nucleótidos que correspondem ao resíduo de fenilalanina na posição 508 da proteína. Esta mutação está presente em cerca de 90% dos pacientes. Esta proteína é expressa em células epiteliais de vários tecidos, e além de funcionar como um canal de cloreto e outros aniões na membrana apical dessas células, é também responsável por regular outros canais e transportadores, tendo um impacto global no transporte iónico epitelial. A fosforilação pela proteína cinase A em resposta a aumento dos níveis de AMP cíclico é considerada o principal mecanismo responsável pela abertura do canal. Ao ser sintetizada, a CFTR é inserida co-traducionalmente na membrana do retículo endoplasmático, onde adquire a sua conformação nativa com o auxílio de vários chaperones aí presentes e sofre uma glicosilação inicial. Do retículo endoplasmático, é transportada para o Golgi, onde os seus resíduos glicídicos são processados até atingir uma forma madura, que é transportada em vesículas para a membrana plasmática, onde exerce a sua função. Uma vez na membrana, a CFTR é endocitada e segue uma de duas vias: ou é reciclada de volta para a membrana ou é enviada para degradação no lisossoma. O balanço destes processos determina a quantidade de proteína presente na membrana, e como tal são relevantes para a compreensão do defeito molecular que origina a doença. As interacções que a CFTR estabelece com outras proteínas ao longo deste trajecto são determinantes para que a proteína consiga exercer convenientemente a sua função. Recentemente, a pequena GTPase Rap1A foi identificada como potencialmente interagindo com a CFTR. O objectivo deste trabalho consistiu na validação dessa interacção e no estabelecimento de um sistema experimental que permitisse avaliar o impacto da Rap1A na biogénese, tráfego e função da CFTR. A Rap1A é uma pequena GTPase da família Ras que está activa quando ligada a GTP e inactiva quando ligada a GDP. A interconversão destas duas formas é auxiliada por proteínas reguladoras chamadas GEFs (activadores) e GAPs (inactivadores), que respondem a uma variedade de estímulos intra e extracelulares. Quando activa, a Rap1A induz alterações conformacionais em determinadas proteínas alvo, envolvidas na regulação da adesão à matriz extracelular e célula-célula, dinâmica do citoesqueleto e polarização celular, alterando a sua função. O primeiro passo do trabalho foi avaliar a expressão da Rap1A no tecido mais relevante do ponto de vista clínico, o pulmão. Para isto, realizaram-se experiências de Western Blot a partir de culturas primárias de células epiteliais dos brônquios de indíviduos saudáveis e de uma linha celular do epitélio brônquico de pacientes com fibrose quística (CFBE) que sobreexpressa CFTR. Observou-se em ambos os tipos celulares expressão da proteína. A estratégia escolhida para validar a interacção entre a CFTR e a Rap1A foi tentar co-imunoprecipitar ambas as proteínas. No entanto, não foi possível validar esta associação, tendo sido unicamente observada uma possível colocalização por ensaios de imunofluorescência. De seguida, foram produzidos com sucesso plasmídeos para expressão da Rap1A wt em fusão com GFP, bem como de um mutante constitutivamente activo e um dominante negativo. O protocolo de transfecção de células CFBE com estes plasmídeos e com siRNAs foi optimizado, embora as eficiências de transfecção atingidas tenham sido modestas. A expressão dos constructos fluorescentes foi analisada por Western Blot e revelou um problema de folding e/ou processamento, provavelmente decorrente da fusão com a GFP. A actividade dos constructos com Rap1A foi também avaliada com um ensaio de actividade específico. Observou-se que o mutante dominante negativo apresentava uma actividade igual ou superior à do constructo wt, enquanto o constitutivamente activo apresentava uma actividade igual ou inferior, o que levou a abandonar ambos estes mutantes. Estas discrepâncias em relação à literatura devem-se provavelmente à marcação com GFP. Em nenhuma destas experiências se observaram alterações na quantidade de CFTR total ou madura. O facto de não se ter observado um efeito pode ter sido devido à baixa eficiência de transfecção obtida, à baixa quantidade de proteína com o folding/processamento correctos ou devido a uma ausência de efeito. Finalmente, recorreu-se a câmaras de Ussing para analisar a função da CFTR em monocamadas polarizadas de células CFBE transfectadas com siRNA contra a Rap1A ou siRNA scrambled. Não se observaram diferenças na corrente transepitelial induzida pelo tratamento com forscolina (um composto que faz aumentar os níveis de AMP cíclico na célula, activando a CFTR) ou com genisteína (um potenciador específico da CFTR que maximiza a abertura do canal) em células tratadas com siRNA contra a Rap e tratadas com siRNA scrambled. Posteriormente, analisando por Western Blot a expressão de Rap1A nestas células, concluiu-se que a transfecção foi pouco eficiente, o que justifica a ausência de efeito. De uma forma geral, houve dois factores limitantes neste trabalho: o facto de, apesar de um longo processo de optimização, as eficiências de transfecção continuarem bastante modestas, e o facto de o sistema de expressão utilizado ser de difícil utilização. As observações mais significativas resultantes deste trabalho são: - Tanto em culturas primárias de células epiteliais humanas dos brônquios e em células CFBE41o- observa-se expressão endógena de Rap1A e Epac. - O padrão de expressão dos factores Epac em células CFBE altera-se quando as células são polarizadas. - Rap1A é expressa abundantemente nas junções célula-célula no epitélio respiratório, onde co-localiza com a E-caderina. - A Rap1A parece co-localizar com a CFTR em células do epitélio respiratório polarizadas. - A quantidade total de CFTR e a quantidade da forma madura (banda C) estão positivamente correlacionadas com os níveis de expressão endógena de Rap1A.CFTR, the protein whose malfunction causes cystic fibrosis, is a chloride channel expressed in the apical membrane of epithelial cells. CFTR undergoes a long journey in the cell, since it is translated in association with the endoplasmic reticulum until its degradation, throughout which it interacts with numerous proteins. One of these was recently identified as Rap1A, a small GTPase that regulates cell-cell and cell-matrix adhesion, cell polarity and cytoskeleton dynamics. The aim of this work was to validate the interaction between CFTR and Rap1A and evaluate the impact of this small GTPase on CFTR biogenesis, trafficking and function. Rap1A expression was observed by Western blot in primary cultures of human bronchial epithelial cells and in the CFBE cell line. Plasmids encoding for several variants of GFP-tagged Rap1A were generated. Transfection with these or with siRNAs was optimized, although only sub-optimal efficiencies were achieved. Expression of Rap1A constructs was analysed by Western Blot, revealing a folding and/or processing defect for most constructs. Rap1A activity assays showed that the constitutively active mutant didn’t have higher activation levels than the wt construct, whereas the dominant negative had more activity than the wt construct, suggesting that the GFP-tagged constructs were not the most appropriate for this kind of study. No effects on CFTR were observed with Rap1A upregulation, possibly because of the low transfection efficiencies. Finally, CFTR function upon knockdown of Rap1A was analyzed in Ussing chambers. However, only a minor trend of decrease of CFTR function was observed for Rap1A siRNA transfected samples. Although suggestive of the need of a different experimental system, the results evidenced that: - Lung epithelial cells have endogenous expression of Rap1A. - The band pattern for Epac changed when CFBE cells were polarized; - Rap1A appears to be enriched in cell-cell junctions, where it co-localizes with Ecadherin; - Rap1A and CFTR seem to overlap; - There seems to be a positive correlation between Rap1A levels and both total CFTR expression and band C intensities

Validação e aplicação clínica de uma escala de cognição social na esquizofrenia = Validation and clinical use of a measure of social cognition in schizophrenia

RESUMO: A cognição social encontra-se frequentemente alterada na esquizofrenia. Esta alteração relaciona-se com a diminuição do funcionamento social,caracterizando-se quer por défices quer por vieses cognitivos sociais. No entanto, existem poucos instrumentos fiáveis e válidos para avaliar a cognição social na esquizofrenia, nomeadamente capazes de medir os vieses cognitivos sociais e a cognição social auto-relevante. Adicionalmente, as bases biológicas da disfunção social não estão totalmente esclarecidas. Evidências recentes sugerem que o peptídeo oxitocina (OXT) influencia o funcionamento social, e que esta relação poderá ser mediada pela cognição social. Este Trabalho de Projecto descreve a contribuição do autor para o desenvolvimento e avaliação psicométrica inicial de um novo instrumento de avaliação da cognição social, e a utilidade desta escala na investigação das associações entre a OXT e a capacidade e vieses cognitivos sociais. A Waiting Room Task (WRT), uma escala constituída por 26 vídeos sequenciais que simulam a experiência de observar outra pessoa numa sala de espera, foi administrada num estudo transversal com 61 doentes com esquizofrenia e 20 controlos saudáveis. Observou-se uma menor capacidade cognitiva social e um aumento dos vieses cognitivos sociais nos doentes com esquizofrenia, comparativamente aos controlos. Nos controlos e doentes com delírios, o desempenho na WRT correlacionou-se significativamente com os níveis de OXT. Esta correlação não se observou nos doentes sem delírios, sugerindo que o papel da OXT na cognição social poderá encontrar-se atenuado neste grupo. Estes achados fornecem suporte inicial para a adequação da WRT como instrumento de avaliação da cognição social na esquizofrenia, podendo ainda ser útil na investigação da sua base biológica. ------------ ABSTRACT: Social cognition is often impaired in schizophrenia. This impairment is related to poor social functioning and is characterized by both social cognitive deficits and biases. However, there are few reliable and valid measures of social cognition in schizophrenia, particularly measures of social cognitive bias and of self-relevant social cognition. Also, the biological bases of social dysfunction are not well understood. Emerging evidence suggests that the peptide oxytocin (OXT) influences social functioning, and that this relationship may be mediated by social cognition. This Research Project describes the author’s contribution to the development and initial psychometric testing of a new measure of social cognition, and the utility of this instrument to examine associations between OXT and social cognitive capacity and bias. The Waiting Room Task WRT), a video-based test comprising 26 sequential videos simulating the experience of facing another person in a waiting room, was administered in a cross-sectional study involving 61 patients with schizophrenia and 20 healthy controls. Social cognitive capacity was lower and social cognitive bias was increased in patients with schizophrenia compared with controls. Among controls and patients with delusions, performance on the WRT was significantly correlated with OXT level. This correlation was not found in patients without delusions suggesting that OXT’s role in social cognition may be blunted in this group. These findings provide initial support for the adequacy of the WRT as a measure for assessing social cognition in schizophrenia that may also be useful in understanding its biological underpinnings

An illustrative example of refactoring object-oriented source code with aspect-oriented mechanisms

This paper describes a refactoring process that transforms a Java source code base into a functionally equivalent AspectJ source code base. The process illustrates the use of a collection of refactorings for aspect-oriented source code, covering the extraction of scattered implementation elements to aspects, the internal reorganization of the extracted aspects and the extraction of commonalities to super-aspects.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) - POSC/EIA/60189/200

C++ é inadequado para ensinar OO

Num curso superior de Informática não deve haver preocupação em ensinar a última novidade tecnológica, mas antes os fundamentos que permitam aos diplomados uma capacidade para aprender continuamente. No ensino da programação orientada ao objecto (POO) é importante utilizar-se uma linguagem com suporte coerente dos conceitos fundamentais do paradigma, sem características que entrem em contradição com o modelo central, sob pena da linguagem se tornar um obstáculo à aprendizagem. Neste artigo argumenta-se precisamente que C++ é um obstáculo à aprendizagem da POO. Muitos alunos acreditam que aprender C++ lhes dará todas as competências na área da programação de que necessitarão no futuro. Esta visão errada tem como consequência que poderão ficar pior preparados para se adaptarem às mudanças a que a informática está sujeita. C++ foi criado tendo em vista a compatibilidade com o C, pelo que todas as decisões de concepção do C++ estiveram dependentes das características, boas ou más, da linguagem anterior. Só este facto já permite questionar se tudo o que o C++ oferece será coerente, sobretudo se se considerar que o próprio C, por vezes classificado de “linguagem assembly estruturada”, dá suporte a vários paradigmas da programação. Na verdade C++ não é uma linguagem orientada ao objecto (LOO), mas uma linguagem multiparadigma, dotada dum suporte imperfeito dos conceitos da OO, misturados com conceitos oriundos de modelos de programação mais antigos. A seguir alude-se a alguns dos principais aspectos técnicos em que C++ apresenta imperfeições no suporte à POO. São feitas comparações com algumas das LOOs mais importantes, sobretudo Eiffel e Java

Some thoughts on refactoring objects to aspects

The prospect of aspect-orientation receiving widespread acceptance and adoption in the near future begs the question of how to deal with a large base of object-oriented legacy code. We propose to investigate refactoring techniques for restructuring object-oriented source code so that it can leverage the mechanisms of aspect-orientation in order to become easier to adapt, extend and evolve. Our approach is to adopt an object-oriented framework in the area of workflow as a non-trivial case study. We plan to analyse its source code, develop an aspect-oriented version through the progressive use of manual refactorings, and build a catalogue of refactoring operations based on the experience gained through the process

Pitfalls of aspectJ implementations of some of the gang-of-four design patterns

For the previous edition of this workshop [8], the authors wrote a paper presenting the aims of the first author’s Ph.D. project [13], which includes the development of a catalogue of refactorings [3] for the AspectJ programming language [1]. Case studies are be used for refactoring experiments, to gain the necessary insights. In this paper, we present several considerations on some code examples in AspectJ [10] from our second case study. They look like a critique, which may lead readers to assume we have a low opinion of them. That is not the case: we largely consider them a success, and proved to be a rich source of insights. Our intent is to simply point out some problems in using the code examples, thus contributing to their analysis. This is done in section 2. We take the opportunity provided by this paper to present, in section 3, an update on a style rule proposed in the previous paper [13]. In section 4 we conclude the paper.PRODEP III - Medida 5 - Acção 5.3 - Eixo 3 - Formação Avançada de Docentes do Ensino Superior; PPC-VM - POSI/CHS/47158/2002

Refactoring a java code base to aspectJ: an illustrative example

This paper describes a refactoring process transforming a Java code base into an AspectJ equivalent. The process illustrates 17 aspect-oriented refactorings covering extraction of implementation elements to aspects, internal reorganization of extracted aspects, and extraction of commonalities to superaspects.(undefined

Sound based social networks

The sound environment is an eco of the activity and character of each place, often carrying additional information to that made available to the eyes (both new and redundant). It is, therefore, an intangible and volatile acoustic fingerprint of the place, or simply an acoustic snapshot of a single event. Such rich resource, full of meaning and subtleness, Schaeffer called Soundscape. The exploratory research project presented here addresses the Soundscape in the context of Mobile Online Social Networking, aiming at determining the extent of its applicability regarding the establishment and/or strengthening of new and existing social links. Such research goal demanded an interdisciplinary approach, which we have anchored in three main stems: Soundscapes, Mobile Sound and Social Networking. These three areas pave the scientific ground for this study and are introduced during the first part of the thesis. An extensive survey of the state-of-the-arte projects related with this research is also presented, gathering examples from different but adjacent areas such as mobile sensing, wearable computing, sonification, social media and contextaware computing. This survey validates that our approach is scientifically opportune and unique, at the same time. Furthermore, in order to assess the role of Soundscapes in the context of Social Networking, an experimental procedure has been implemented based on an Online Social Networking mobile application, enriched with environmental sensing mechanisms, able to capture and analyze the surrounding Soundscape and users' movements. Two main goals guided this prototypal research tool: collecting data regarding users' activity (both sonic and kinetic) and providing users with a real experience using a Sound-Based Social Network, in order to collect informed opinions about this unique type of Social Networking. The application – Hurly-Burly – senses the surrounding Soundscape and analyzes it using machine audition techniques, classifying it according to four categories: speech, music, environmental sounds and silence. Additionally, it determines the sound pressure level of the sensed Soundscape in dB(A)eq. This information is then broadcasted to the entire online social network of the user, allowing each element to visualize and audition a representation of the collected data. An individual record for each user is kept available in a webserver and can be accessed through an online application, displaying the continuous acoustic profile of each user along a timeline graph. The experimental procedure included three different test groups, forming each one a social network with a cluster coefficient equal to one. After the implementation and result analysis stages we concluded that Soundscapes can have a role in the Online Social Networking paradigm, specially when concerning mobile applications. Has been proven that current offthe- shelf mobile technology is a promising opportunity for accomplishing this kind of tasks (such as continuous monitoring, life logging and environment sensing) but battery limitations and multitasking's constraints are still the bottleneck, hindering the massification of successful applications. Additionally, online privacy is something that users are not enthusiastic in letting go: using captured sound instead of representations of the sound would abstain users from utilizing such applications. We also demonstrated that users who are more aware of the Soundscape concept are also more inclined to assume it as playing an important role in OSN. This means that more pedagogy towards the acoustic phenomenon is needed and this type of research gives a step further in that direction.O ambiente sonoro de um lugar é um eco da sua atividade e carácter, transportando, na maior parte da vezes, informação adicional àquela que é proporcionada à visão (quer seja redundante ou complementar). É, portanto, uma impressão digital acústica - tangível e volátil - do lugar a que pertence, ou simplesmente uma fotografia acústica de um evento pontual. A este opulento recurso, carregado de significados e subtilezas, Schafer chamou de Paisagem-Sonora. O projeto de investigação de carácter exploratório que aqui apresentamos visa o estudo da Paisagem-Sonora no contexto das Redes Sociais Móveis Em-Linha, procurando entender os moldes e limites da sua aplicação, tendo em vista o estabelecimento e/ou reforço de novos ou existente laços sociais, respectivamente. Para satisfazer este objectivo foi necessária uma abordagem multidisciplinar, ancorada em três pilares principais: a Paisagem-Sonora, o Som Móvel e as Redes Sociais. Estas três áreas determinaram a moldura científica de referência em que se enquadrou esta investigação, sendo explanadas na primeira parte da tese. Um extenso levantamento do estado-da-arte referente a projetos relacionados com este estudo é também apresentado, compilando exemplos de áreas distintas mas adjacentes, tais como: Computação Sensorial Móvel, Computação Vestível, Sonificação, Média Social e Computação Contexto-Dependente. Este levantamento veio confirmar quer a originalidade quer a pertinência científica do projeto apresentado. Posteriormente, a fim de avaliar o papel da Paisagem-Sonora no contexto das Redes Sociais, foi posto em prática um procedimento experimental baseado numa Rede Social Sonora Em-Linha, desenvolvida de raiz para dispositivos móveis e acrescida de mecanismos sensoriais para estímulos ambientais, capazes de analisar a Paisagem-Sonora envolvente e os movimentos do utilizador. Dois objectivos principais guiaram a produção desta ferramenta de investigação: recolher dados relativos à atividade cinética e sonora dos utilizadores e proporcionar a estes uma experiência real de utilização uma Rede Social Sonora, de modo a recolher opiniões fundamentadas sobre esta tipologia específica de socialização. A aplicação – Hurly-Burly – analisa a Paisagem-Sonora através de algoritmos de Audição Computacional, classificando- a de acordo com quatro categorias: diálogo (voz), música, sons ambientais (“ruídos”) e silêncio. Adicionalmente, determina o seu nível de pressão sonora em dB(A)eq. Esta informação é então distribuída pela rede social dos utilizadores, permitindo a cada elemento visualizar e ouvir uma representação do som analisado. É mantido num servidor Web um registo individual da informação sonora e cinética captada, o qual pode ser acedido através de uma aplicação Web que mostra o perfil sonoro de cada utilizador ao longo do tempo, numa visualização ao estilo linha-temporal. O procedimento experimental incluiu três grupos de teste distintos, formando cada um a sua própria rede social com coeficiente de aglomeração igual a um. Após a implementação da experiência e análise de resultados, concluímos que a Paisagem- Sonora pode desempenhar um papel no paradigma das Redes Sociais Em- Linha, em particular no que diz respeito à sua presença nos dispositivos móveis. Ficou provado que os dispositivos móveis comerciais da atualidade apresentam-se com uma oportunidade promissora para desempenhar este tipo de tarefas (tais como: monitorização contínua, registo quotidiano e análise sensorial ambiental), mas as limitações relacionadas com a autonomia energética e funcionamento em multitarefa representam ainda um constrangimento que impede a sua massificação. Além disso, a privacidade no mundo virtual é algo que os utilizadores atuais não estão dispostos a abdicar: partilhar continuamente a Paisagem-Sonora real em detrimento de uma representação de alto nível é algo que refrearia os utilizadores de usar a aplicação. Também demonstrámos que os utilizadores que mais conhecedores do fenómeno da Paisagem-Sonora são também os que consideram esta como importante no contexto das Redes Sociais Em-Linha. Isso significa que uma atitude pedagógica em relação ao fenómeno sonoro é essencial para obter dele o maior ganho possível. Esta investigação propõe-se a dar um passo em frente nessa direção