Directed evolution of ancestral and modern enzymes

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 18-10-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 18-04-2021Ancestral sequence reconstruction (ASR) and resurrection (i.e. functional expression in a heterologous host) allows enzymes with different properties to be disclosed while its combination with directed evolution may lead to the development of a new generation of biocatalysts. In this Doctoral Thesis we have explored the combination of such powerful methods using as blueprints two different enzyme systems, Rubisco and laccase. In the first chapter of this Thesis we reconstructed and resurrected (in Escherichia coli) Precambrian Rubisco nodes which were evolved in parallel with the extant Rubisco counterpart. An in vitro dual high-throughput screening (HTS) method was set out to identify thermostable and functional variants after- applying a palette of directed evolution strategies. The stronger tolerance to mutational loads, the improved expression and the different kinetic behavior were some of the traits that highlighted in the Precambrian enzyme. Particularly, the evolved ancestral Clone B2 stood out as a case study of this elusive protein due to its alternative performance in the classical equilibrium of Rubisco kinetic constants. In the second chapter we focused ASR and directed evolution on basidiomycete laccases. Firstly, ancestral nodes from the Paleozoic were reconstructed and resurrected in Saccharomyces cerevisiae. The resurrected enzymes showed a higher heterologous expression and a broader pH stability profile than the modern -laboratory evolved- counterpart. The most promising ancestral node was subjected to structure-guided evolution for the oxidation of β–diketones, an unusual type of redox mediators capable to initiate the polymerization of vinyl monomers. The final chapter of the Thesis deals with consensus design, a long-standing protein engineering method to increase stability without compromising activity. We applied an in-house consensus method to stabilize a laboratory evolved high-redox potential laccase. Multiple sequence alignments were carried out and computationally refined by applying relative entropy and mutual information thresholds. Through this approach, an ensemble of 20 consensus mutations were identified, 18 of which were consensus ancestral mutations. After analyzing potential epistasis by site directed recombination in vivo, the best mutant was characterized displaying dramatically improved thermostability, kinetic values and secretion levels.La reconstrucción y resurrección (i.e. expresión funcional en un hospedador heterólogo) de secuencias ancestrales permite obtener enzimas con diferentes propiedades que al ser combinadas con la evolución dirigida pueden dar lugar al desarrollo de una nueva generación de biocatalizadores. En la presente Tesis Doctoral hemos explorado la combinación de estos potentes métodos usando como modelos dos sistemas enzimáticos diferentes, Rubisco y lacasa. En el primer capítulo se reconstruyeron y resucitaron (en Escherichia coli) nodos de rubiscos Precámbricas con el fin de evolucionarlos en paralelo con una versión moderna de Rubisco. Se desarrolló un método de cribado dual in vitro para poder identificar variantes termoestables y funcionales tras aplicar varias estrategias de evolución dirigida. Las enzimas Precámbricas destacaron por una alta tolerancia a tasas mutagénicas, expresión funcional mejorada y valores cinéticos diferentes a los de las enzimas modernas. En particular, la rubisco ancestral evolucionada, clon B2, despuntó como caso de estudio de esta complicada enzima debido al comportamiento alternativo que muestra con respecto al equilibrio clásico de las constantes cinéticas de la Rubisco. En el segundo capítulo se llevo a cabo la resurrección y evolución dirigida de lacasas de basidiomicetos. En primer lugar se reconstruyeron y resucitaron en Saccharomyces cerevisiae nodos ancestrales del Paleozoico. Las enzimas ancestrales mostraron mayor nivel de expresión heteróloga así como un perfil de estabilidad a diferentes pHs más amplio que el de la versión –evolucionada en el laboratorio- moderna. El nodo ancestral más prometedor fue sometido a evolución estructuralmente guiada para la oxidación de β-dicetonas, un tipo de mediador redox poco usual capaz de iniciar la polimerización de monómeros de vinilo. El capítulo final de la Tesis trata sobre el diseño consenso, un método clásico de ingeniería de proteínas para aumentar la estabilidad sin afectar a la actividad. Se aplicó un método consenso propio para la estabilización de una lacasa de alto potencial redox evolucionada en el laboratorio. Se llevó a cabo un alineamiento de múltiples secuencias que fue refinado computacionalmente mediante el uso de los marcadores de entropía relativa e información mutua. Mediante este procedimiento se identificaron 20 mutaciones consenso, 18 de las cuales corresponden a mutaciones ancestrales-consenso. Se analizó la posible epistasia de estas mutaciones mediante recombinación dirigida in vivo y se caracterizó el mejor mutante que presentó mayores niveles de estabilidad, valores cinéticos y secreciónLa presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo gracias a la financiación recibida a través de una beca para la formación de personal investigador (FPI) del Ministerio de Economía y Competitividad (BES-2014-068887) dentro de los proyectos nacionales DEWRY (BIO2013-43407-R) y LIGNOLUTION (BIO2016-79106-R)

Phenomenological model of visual acuity

We propose in this work a model for describing visual acuity (VV) as a function of defocus and pupil diameter. Although the model is mainly based on geometrical optics, it also incorporates nongeometrical effects phenomenologically. Compared to similar visual acuity models, the proposed one considers the effect of astigmatism and the variability of best corrected VV among individuals; it also takes into account the accommodation and the “tolerance to defocus,” the latter through a phenomenological parameter. We have fitted the model to the VV data provided in the works of Holladay et al. and Peters, showing the ability of this model to accurately describe the variation of VV against blur and pupil diameter. We have also performed a comparison between the proposed model and others previously published in the literature. The model is mainly intended for use in the design of ophthalmic compensations, but it can also be useful in other fields such as visual ergonomics, design of visual tests, and optical instrumentation

Brakes and barriers of Corporate Volunteering

The objective of this research is to study which are the determinants for the participation of employees in Corporate Volunteer actions -hereafter CV- that can become barriers and brakes, and which ones can mean negative consequences for the company. Ignorance of managers for these programs, about which are those brakes and its relevance, may be behind the low participation fees that companies have in their Corporate Volunteering Programs.For this purpose, we conducted a qualitative empirical study to define a model, based on the motivations and determinants of employee participation in corporate volunteer programs. The methodology that we use in order to advance the understanding of this field is common in the dynamics of so-called Discussion Groups or Focus Group (FG). We believe that this methodological approach fits well with the research question and objectives that guide us in this work, since it will allow the reconstruction of real social situations and to capture the interaction between different discourses.We trust the fact the model proposed really allows advance in knowledge of Corporate Volunteer field, as literature suggested, and we offer a conceptual framework to managers in order to develop CV programs that allows mitigating potential risks and increasing employee participation effectively

Conferencia: Secciones condensadas y máximos transgresivos. Una relación equívoca

El método analítico de la estratigrafía secuencial permite aclarar la organización espacio-temporal de los depósitos en las cuencas sedimentarias. Sin embargo, la distribución relativa de las inconformidades y de las secciones condensadas no puede seguir siendo utilizada como criterio diagnóstico de una localización paleogeográfica particular, o de cambios eustáticos hacia condiciones más oceánicas o de mayor profundidad, en relación con etapas de máxima transgresión regional. [ABSTRACT] Sequence stratigraphy allows to elucida te the time-space organization of the deposits in the sedimentary basins. However, the relative distribution of the unconformities as well as of the condensed sections can neither be used as a diagnostic criteria for a particular paleogeographic setting, nor as an indicator of eustatic changes towards deeper conditions related to maximum regional transgressions. Condensation processes can occur during maximum transgressive stages in the distal portion of the basins, but condensation processes are also present along maximum regression stages in the shallowest portions of the platforms. Condensed sections are not only related to the maximum flooding surfaces but also to the systems tracts generated under low sea level conditions. The stratigraphic, sedimentary and taphonomic condensation concepts are useful to analyze the sediments distribution patterns in the sedimentary basins, and also to estima te the lateral and vertical variations in rates (VTS) and sedimentation velocities (VVS). Against the most usual in terpretation about the development of the shallowing-upward sequences or parasequences, the maximum rate, velocity, and amount of accommodation values, as well as the highest relative depth, correspond to the lowest le veIs of these sequences, and are decreasing towards the topo Durante las etapas de máxima transgresión pueden ocurrir procesos de condensación en las partes distales de las cuencas, pero también hay procesos de condensación durante las etapas de máxima regresión en las partes más someras de las plataformas. Las secciones condensadas no sólo están asociadas a las superficies de máxima transgresión sino también a los cortejos generados en condiciones de bajo nivel del mar. Los conceptos de condensación estratigráfica, condensación sedimentaria y condensación tafonómica son útiles para analizar las pautas de distribución de los sedimentos en las cuencas, así como para estimar las variaciones laterales y verticales de las tasas (VTS) y de las velocidades de sedimentación (VVS). En contra de la interpretación más usual del desarrollo de las secuencias de somerización o de las parasecuencias, los máximos valores de tasa, velocidad, profundidad relativa y grado de acomodación de los sedimentos de estas secuencias corresponden a los niveles basales, y los valores de estas variables disminuyen hacia el techo. La distinción entre los procesos de condensación de estas tres categorías permite predecir que los grados de condensación sedimentaria y de condensación estratigráfica serán mayores hacia las partes distales de las plataformas; mientras que los procesos de condensación estratigráfica sin condensación sedimentaria presentarán su máxima intensidad y frecuencia en las áreas más someras de las plataformas. Las secciones condensadas pueden servir para evidenciar ciclos eustáticos y para establecer correlaciones temporales. Sin embargo, si se siguen correlacionando indiscriminadamente las secciones condensadas de las zonas medias y distales de las cuencas, generadas durante máximos transgresivos, con las secciones condensadas de las zonas proximales, debidas a máximos regresivos, las correlaciones temporales establecidas serán tan diacrónicas como las facies más progradantes o retrogradan tes desarrolladas en las plataformas. The distinction between processes of each one of the three categories of condensation allows to make the prediction that sedimentary and stratigraphic condensation degrees will be higher towards the distal portions of the platforms, whilst the stratigraphic condensation processes without sedimentary condensation will show the maximum intensity and frequency in the shallowest portions of the platforms. Condensed sections can serve to evidence eustatic cycles and the establishment of temporal correlations. However, if the condensed sections from the middle and distal portions of the basins, generated during maximum transgressions, are correlated with the condensed sections of the proximal zones, due to regressive maximums, the temporal correlations can be as diachronous as the most retrogradational or progradational facies developed in the shelves

Jurásico Medio

Depto. de Geodinámica, Estratigrafía y PaleontologíaFac. de Ciencias GeológicasTRUEpu

Propuesta de un modelo y factores determinantes de la fragmentación internacional de la producción en el sector automóvil de España

Una de los rasgos más característicos de la presente globalización es el desarrollo de la fragmentación de la producción, siendo esta, la división del proceso productivo en diferentes localizaciones a lo largo de varios países. Debido a la globalización de los mercados, al surgimiento de nuevas zonas económicas (Zona Euro, Nafta, Mercosur, etc.), a los países emergentes (China, India, Rusia, Brasil), a la reducción de los costes del transporte internacional y al desarrollo de las comunicaciones, ha provocado el incremento del comercio internacional en bienes intermedios, así como el diseño, fabricación y ensamblaje de un producto en diferentes localizaciones a lo largo de varios países. El incremento de la fragmentación en el comercio internacional ha creado un interés por saber cuales son los factores determinantes de la misma en bienes intermedios. El indicador IITV es el utilizado para medir la fragmentación de la producción entre España y sus 19 principales socios comerciales y varios factores sugeridos por la literatura en fragmentación son utilizados en un rango de años desde el año 2004 al año 2008. Los resultados obtenidos muestran que la gran mayoría del comercio en bienes intermedios es IITV y los factores determinantes de la fragmentación de la producción en el sector del automóvil en España, son el tamaño del mercado, la pertenencia a UE, la distancia y el coeficiente de libre comercio

El Jurásico en la región de Chelva-Domeño (Valencia)

Depto. de Geodinámica, Estratigrafía y PaleontologíaFac. de Ciencias GeológicasTRUEpu

The Middle Jurassic eastern margin of the Iberian platform system (eastern Spain). Palaeogeography and biodispersal routes of ammonoids.

From a sedimentological and palaeogeographical point of view, in the eastern margin of the Iberian platform system, Middle Jurassic deposits are represented by a thick pile of carbonates with minor marls interbedded. Different facies, within the Tortosa, Aragonese and Castilian platforms, pertain to two categories: internal platform and external platform facies. A system of extensional faults was the major factor determining the differentiation of several shallow, carbonate, epicontinental platforms. The so-called Iberian Basin was a shallow intracratonic platform system, in which a relatively deep extensional basin (the Catalan Basin) started to be differentiated during the late Bajocian. In the eastern part of this faulted platform system, the occurrence of a listric fault, dipping towards the east, conditioned the development of a late Bajocian differentiated subsident area named the Tortosa Platform. From a palaeobiogeographical point of view, the ammonite fossil assemblages of the Iberian platforms are composed of Sub-Mediterranean taxa. At the eastern margin of the Iberian platform system, the appearance and distribution of shells of ammonoids were taphonomically and ecologically controlled by regional changes of relative sea level. A Sub-Mediterranean zonation can be recognized, although most of the ammonites shells correspond to adult individuals arrived by necroplanktic drift from more open-marine or oceanic areas. The following criteria are relevant in recognizing the maximum deepening episodes in the Iberian platform system: colonization (including ontogenic development) of open-marine taxa, immigration of oceanic taxa and development of endemic species. In terms of Sequence Stratigraphy, the development of expanded, external platform sections in the Tortosa Platform during the Garantiana Biochron (late Bajocian) is noteworthy. During this episode, the Iberian platform system reached the maximum bathymetric values and acted as a biogeographical dispersal area for some taxonomic groups of ammonoids between the Western Tethys and the Proto-Atlantic

Propuesta de un Modelo para la Gestión de los Neumáticos de Una flota de Vehículos

En la gestión de los neumáticos de una flota de vehículos el mejor ratio para ello es el coste del neumático dividido por las Horas o Km. realizados por el neumático, pero existen flotas de vehículos que por sus características de uso no se puede realizar un seguimiento de las horas o Km. que realiza el neumático en su vida útil ya que son vehículos que son utilizados por un gran número de conductores en diferentes turnos al día. Este tipo de flotas suelen operar en entornos urbanos y son: Vehículos destinados a la limpieza viaria, recogida de basuras, mantenimiento de jardines, Policía, Guardia Civil, Bomberos etc. así también en menor medida flotas de empresas, renting de vehículos, alquiler de vehículos etc. por ello se propone un modelo de gestión de neumáticos para una flota de vehículos en los que no se puede hacer un seguimiento de las horas o kilómetros realizados por el neumático en su uso

Outsourcing en la Indústria de Fabricantes de Vehículos en España: Evolución, Tendencias, Causas y Consecuencias.

Winds as an environmental factor can cause significant difficulties for the railway system operation. The rail way overhead has been particularly vulnerable to cross-winds related problems, such as development of und amped oscillations due to galloping phenomenon. The installation of windbreaks to decrease the aerodynamic loads on the train can affect the loads on railway overheads triggering cable galloping. One essential parameter to indicate the influence of the parapet wake on the catenary contact wire is the turbulence intensity. In this paper the results of an experimental analysis of the turbulence intensity due to the presence of parapets carried out in a wind tunnel are reported. Embankments equipped with different parapets have been tested and turbulence intensity has been measured at both contact wire locations, windward and leeward. The relative influence of the parapets is measured through a reduced turbulence intensity, defined as the ratio between the turbulence intensity measured with parapet and the turbulence intensity in the case without any parapet on the embankment. In general the reduced turbulence intensity increases as the height of the parapet increases