Directed evolution of ancestral and modern enzymes

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 18-10-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 18-04-2021Ancestral sequence reconstruction (ASR) and resurrection (i.e. functional expression in a heterologous host) allows enzymes with different properties to be disclosed while its combination with directed evolution may lead to the development of a new generation of biocatalysts. In this Doctoral Thesis we have explored the combination of such powerful methods using as blueprints two different enzyme systems, Rubisco and laccase. In the first chapter of this Thesis we reconstructed and resurrected (in Escherichia coli) Precambrian Rubisco nodes which were evolved in parallel with the extant Rubisco counterpart. An in vitro dual high-throughput screening (HTS) method was set out to identify thermostable and functional variants after- applying a palette of directed evolution strategies. The stronger tolerance to mutational loads, the improved expression and the different kinetic behavior were some of the traits that highlighted in the Precambrian enzyme. Particularly, the evolved ancestral Clone B2 stood out as a case study of this elusive protein due to its alternative performance in the classical equilibrium of Rubisco kinetic constants. In the second chapter we focused ASR and directed evolution on basidiomycete laccases. Firstly, ancestral nodes from the Paleozoic were reconstructed and resurrected in Saccharomyces cerevisiae. The resurrected enzymes showed a higher heterologous expression and a broader pH stability profile than the modern -laboratory evolved- counterpart. The most promising ancestral node was subjected to structure-guided evolution for the oxidation of β–diketones, an unusual type of redox mediators capable to initiate the polymerization of vinyl monomers. The final chapter of the Thesis deals with consensus design, a long-standing protein engineering method to increase stability without compromising activity. We applied an in-house consensus method to stabilize a laboratory evolved high-redox potential laccase. Multiple sequence alignments were carried out and computationally refined by applying relative entropy and mutual information thresholds. Through this approach, an ensemble of 20 consensus mutations were identified, 18 of which were consensus ancestral mutations. After analyzing potential epistasis by site directed recombination in vivo, the best mutant was characterized displaying dramatically improved thermostability, kinetic values and secretion levels.La reconstrucción y resurrección (i.e. expresión funcional en un hospedador heterólogo) de secuencias ancestrales permite obtener enzimas con diferentes propiedades que al ser combinadas con la evolución dirigida pueden dar lugar al desarrollo de una nueva generación de biocatalizadores. En la presente Tesis Doctoral hemos explorado la combinación de estos potentes métodos usando como modelos dos sistemas enzimáticos diferentes, Rubisco y lacasa. En el primer capítulo se reconstruyeron y resucitaron (en Escherichia coli) nodos de rubiscos Precámbricas con el fin de evolucionarlos en paralelo con una versión moderna de Rubisco. Se desarrolló un método de cribado dual in vitro para poder identificar variantes termoestables y funcionales tras aplicar varias estrategias de evolución dirigida. Las enzimas Precámbricas destacaron por una alta tolerancia a tasas mutagénicas, expresión funcional mejorada y valores cinéticos diferentes a los de las enzimas modernas. En particular, la rubisco ancestral evolucionada, clon B2, despuntó como caso de estudio de esta complicada enzima debido al comportamiento alternativo que muestra con respecto al equilibrio clásico de las constantes cinéticas de la Rubisco. En el segundo capítulo se llevo a cabo la resurrección y evolución dirigida de lacasas de basidiomicetos. En primer lugar se reconstruyeron y resucitaron en Saccharomyces cerevisiae nodos ancestrales del Paleozoico. Las enzimas ancestrales mostraron mayor nivel de expresión heteróloga así como un perfil de estabilidad a diferentes pHs más amplio que el de la versión –evolucionada en el laboratorio- moderna. El nodo ancestral más prometedor fue sometido a evolución estructuralmente guiada para la oxidación de β-dicetonas, un tipo de mediador redox poco usual capaz de iniciar la polimerización de monómeros de vinilo. El capítulo final de la Tesis trata sobre el diseño consenso, un método clásico de ingeniería de proteínas para aumentar la estabilidad sin afectar a la actividad. Se aplicó un método consenso propio para la estabilización de una lacasa de alto potencial redox evolucionada en el laboratorio. Se llevó a cabo un alineamiento de múltiples secuencias que fue refinado computacionalmente mediante el uso de los marcadores de entropía relativa e información mutua. Mediante este procedimiento se identificaron 20 mutaciones consenso, 18 de las cuales corresponden a mutaciones ancestrales-consenso. Se analizó la posible epistasia de estas mutaciones mediante recombinación dirigida in vivo y se caracterizó el mejor mutante que presentó mayores niveles de estabilidad, valores cinéticos y secreciónLa presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo gracias a la financiación recibida a través de una beca para la formación de personal investigador (FPI) del Ministerio de Economía y Competitividad (BES-2014-068887) dentro de los proyectos nacionales DEWRY (BIO2013-43407-R) y LIGNOLUTION (BIO2016-79106-R)