Identificación de genes regulados por el sistema CpxAR en Serratia marcescens

Los sistemas de dos componentes (TCS, pos sus siglas en inglés) son mecanismos de señalización utilizados por las bacterias para regular la expresión diferencial de múltiples genes. El sistema CpxAR es un TCS conservado cuya función se ha relacionado principalmente con la respuesta al estrés de envoltura, sin embargo, también se ha reportado que contribuye en la regulación de genes de virulencia y de resistencia a antibióticos en bacterias de importancia clínica. Serratia marcescens es un patógeno emergente que ha cobrado relevancia durante las últimas décadas debido al incremento en el número de infecciones y la letalidad de las mismas, aspecto asociada con la multi-resistencia intrínseca de esta bacteria. A la fecha se conoce muy poco sobre el sistema CpxAR de S. marcescens y los genes regulados por este TCS, no obstante, los antecedentes sugieren que la secuencia de DNA que reconoce CpxR se encuentra conservada entre bacterias relacionadas. Con el objetivo de identificar los posibles genes regulados por el sistema CpxAR en S. marcescens en este proyecto se utilizaron 2 motivos consenso a partir de secuencias de unión de CpxR previamente reportadas, estos 2 motivos se utilizaron para analizar el genoma de S. marcescens mediante el programa FIMO. La curación manual de los resultados obtenidos arrojó un total de 92 (motivo 1) y 109 (motivo 2) posibles genes blanco de CpxR en S. marcescens. Para validar experimentalmente la predicción de sitios de unión de CpxR en primer lugar se amplificó el gen cpxR a partir de DNA genómico de S. marcescens y se clonó en el plásmido pET19b. La construcción pET19b-cpxR se utilizó para purificar mediante cromatografía de afinidad una versión recombinante de His-CpxR. Por otra parte, se amplificó mediante PCR la región promotora de los genes slyA y ssmE (motivo 1), y mdtH y eepR (motivo 2). La interacción in vitro de His-CpxR con las regiones promotoras (PslyA, PssmE, PmdtH, y PeepR) se evaluó mediante ensayos de cambio en la movilidad electroforética (EMSA). Los resultados confirmaron la interacción de CpxR con los promotores correspondientes a los motivos 1 y 2. Adicionalmente, una mutante puntual espontánea de CpxR en la leucina 208 de la α-hélice 8, evidenció un papel importante de dicho residuo hidrofóbico en la interacción de CpxR con las moléculas de DNA. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que el sistema CpxAR contribuye a la regulación de factores de virulencia y genes asociados con la resistencia a antimicrobianos en S. marcescens

Analysis of Customer Behaviour in the Cash & Carry Wholesale

Import 04/11/2015Tato bakalářská práce se zabývá analýzou nákupního chování mezi dvěma segmenty - vietnamskými a českými zákazníky, v ostravské prodejně Makro. Hlavním cílem práce je najít a porovnat rozdílné chování mezi těmito dvěma segmenty, ale i jejich podobnosti při nákupu v prodejně. Dílčím cílem je zjistit, proč zákazníci nenakupují v ostravské prodejně Makro častěji.This bachelor work focuses on the analysis of shopping behavior between the two segments - the Vietnamese and Czech customers in Ostrava Makro. The main objective is to find and compare the different behavior between these two segments, but also their similarities when customers buying in a store. Partial aim is to find out why customers do not buy in Ostrava Makro more often.116 - Katedra marketingu a obchoduvelmi dobř

Anticancer potential of Thevetia peruviana fruit methanolic extract

Abstract Background: Thevetia peruviana (Pers.) K. Schum or Cascabela peruviana (L.) Lippold (commonly known as ayoyote, codo de fraile, lucky nut, or yellow oleander), native to Mexico and Central America, is a medicinal plant used traditionally to cure diseases like ulcers, scabies, hemorrhoids and dissolve tumors. The purpose of this study was to evaluate the cytotoxic, antiproliferative and apoptotic activity of methanolic extract of T. peruviana fruits on human cancer cell lines. Methods: The cytotoxic activity of T. peruviana methanolic extract was carried out on human breast, colorectal, prostate and lung cancer cell lines and non-tumorigenic control cells (fibroblast and Vero), using the MTT assay. For proliferation and motility, clonogenic and wound-healing assays were performed. Morphological alterations were monitored by trypan blue exclusion, as well as DNA fragmentation and AO/EB double staining was performed to evaluate apoptosis. The extract was separated using flash chromatography, and the resulting fractions were evaluated on colorectal cancer cells for their cytotoxic activity. The active fractions were further analyzed through mass spectrometry. Results: The T. peruviana methanolic extract exhibited cytotoxic activity on four human cancer cell lines: prostate, breast, colorectal and lung, with values of IC50 1.91 ± 0.76, 5.78 ± 2.12, 6.30 ± 4.45 and 12.04 ± 3.43 μg/mL, respectively. The extract caused a significant reduction of cell motility and colony formation on all evaluated cancer cell lines. In addition, morphological examination displayed cell size reduction, membrane blebbing and detachment of cells, compared to non-treated cancer cell lines. The T. peruviana extract induced apoptotic cell death, which was confirmed by DNA fragmentation and AO/EB double staining. Fractions 4 and 5 showed the most effective cytotoxic activity and their MS analysis revealed the presence of the secondary metabolites: thevetiaflavone and cardiac glycosides. Conclusion: T. peruviana extract has potential as natural anti-cancer product with critical effects in the proliferation, motility, and adhesion of human breast and colorectal cancer cells, and apoptosis induction in human prostate and lung cancer cell lines, with minimal effects on non-tumorigenic cell lines. Keywords: Cytotoxic activity, Anti-proliferative activity, Motility, Apoptosis, Human cancer cells, Flavonoid, Cardiac glycoside

Burkholderia cenocepacia and Salmonella enterica ArnT proteins that transfer 4-amino-4-deoxy-L-arabinose to lipopolysaccharide share membrane topology and functional amino acids

We recently demonstrated that incorporation of 4-amino-4-deoxy-l-arabinose (l-Ara4N) to the lipid A moiety of lipopolysaccharide (LPS) is required for transport of LPS to the outer membrane and viability of the Gram-negative bacterium Burkholderia cenocepacia. ArnT is a membrane protein catalyzing the transfer of l-Ara4N to the LPS molecule at the periplasmic face of the inner membrane, but its topology and mechanism of action are not well characterized. Here, we elucidate the topology of ArnT and identify key amino acids that likely contribute to its enzymatic function. PEGylation assays using a cysteineless version of ArnT support a model of 13 transmembrane helices and a large C-terminal region exposed to the periplasm. The same topological configuration is proposed for the Salmonella enterica serovar Typhimurium ArnT. Four highly conserved periplasmic residues in B. cenocepacia ArnT, tyrosine-43, lysine-69, arginine-254 and glutamic acid-493, were required for activity. Tyrosine-43 and lysine-69 span two highly conserved motifs, (42)RYA(44) and (66)YFEKP(70), that are found in ArnT homologues from other species. The same residues in S. enterica ArnT are also needed for function. We propose these aromatic and charged amino acids participate in either undecaprenyl phosphate-l-Ara4N substrate recognition or transfer of l-Ara4N to the LPS

ArnT proteins that catalyse the glycosylation of lipopolysaccharide share common features with bacterial N-oligosaccharyltransferases

ArnT is a glycosyltransferase that catalyzes the addition of 4-amino-4-deoxy-l-arabinose (l-Ara4N) to the lipid A moiety of the lipopolysaccharide. This is a critical modification enabling bacteria to resist killing by antimicrobial peptides. ArnT is an integral inner membrane protein consisting of 13 predicted transmembrane helices and a large periplasmic C-terminal domain. We report here the identification of a functional motif with a canonical consensus sequence DEXRYAX((5))MX((3))GXWX((9))YFEKPX((4))W spanning the first periplasmic loop, which is highly conserved in all ArnT proteins examined. Site-directed mutagenesis demonstrated the contribution of this motif in ArnT function, suggesting that these proteins have a common mechanism. We also demonstrate that the Burkholderia cenocepacia and Salmonella enterica serovar Typhimurium ArnT C-terminal domain is required for polymyxin B resistance in vivo. Deletion of the C-terminal domain in B. cenocepacia ArnT resulted in a protein with significantly reduced in vitro binding to a lipid A fluorescent substrate and unable to catalyze lipid A modification with l-Ara4N. An in silico predicted structural model of ArnT strongly resembled the tertiary structure of Campylobacter lari PglB, a bacterial oligosaccharyltransferase involved in protein N-glycosylation. Therefore, distantly related oligosaccharyltransferases from ArnT and PglB families operating on lipid and polypeptide substrates, respectively, share unexpected structural similarity that could not be predicted from direct amino acid sequence comparisons. We propose that lipid A and protein glycosylation enzymes share a conserved catalytic mechanism despite their evolutionary divergence

Identificación de genes regulados por el sistema CpxAR en Serratia marcescens

RESUMEN Los sistemas de dos componentes (TCS, pos sus siglas en inglés) son mecanismos de señalización utilizados por las bacterias para regular la expresión diferencial de múltiples genes. El sistema CpxAR es un TCS conservado cuya función se ha relacionado principalmente con la respuesta al estrés de envoltura, sin embargo, también se ha reportado que contribuye en la regulación de genes de virulencia y de resistencia a antibióticos en bacterias de importancia clínica. Serratia marcescens es un patógeno emergente que ha cobrado relevancia durante las últimas décadas debido al incremento en el número de infecciones y la letalidad de las mismas, aspecto asociada con la multi-resistencia intrínseca de esta bacteria. A la fecha se conoce muy poco sobre el sistema CpxAR de S. marcescens y los genes regulados por este TCS, no obstante, los antecedentes sugieren que la secuencia de DNA que reconoce CpxR se encuentra conservada entre bacterias relacionadas. Con el objetivo de identificar los posibles genes regulados por el sistema CpxAR en S. marcescens en este proyecto se utilizaron 2 motivos consenso a partir de secuencias de unión de CpxR previamente reportadas, estos 2 motivos se utilizaron para analizar el genoma de S. marcescens mediante el programa FIMO. La curación manual de los resultados obtenidos arrojó un total de 92 (motivo 1) y 109 (motivo 2) posibles genes blanco de CpxR en S. marcescens. Para validar experimentalmente la predicción de sitios de unión de CpxR en primer lugar se amplificó el gen cpxR a partir de DNA genómico de S. marcescens y se clonó en el plásmido pET19b. La construcción pET19b-cpxR se utilizó para purificar mediante cromatografía de afinidad una versión recombinante de His-CpxR. Por otra parte, se amplificó mediante PCR la región promotora de los genes slyA y ssmE (motivo 1), y mdtH y eepR (motivo 2). La interacción in vitro de His-CpxR con las regiones promotoras (PslyA, PssmE, PmdtH, y PeepR) se evaluó mediante ensayos de cambio en la movilidad electroforética (EMSA). Los resultados confirmaron la interacción de CpxR con los promotores correspondientes a los motivos 1 y 2. Adicionalmente, una mutante puntual espontánea de CpxR en la leucina 208 de la α-hélice 8, evidenció un papel importante de dicho residuo hidrofóbico en la interacción de CpxR con las moléculas de DNA. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que el sistema CpxAR contribuye a la regulación de factores de virulencia y genes asociados con la resistencia a antimicrobianos en S. marcescens

In vitro anticancer activity of methanolic extract of Granulocystopsis sp., a microalgae from an oligotrophic oasis in the Chihuahuan desert

With the purpose of discovering new anticancer molecules that might have fewer side effects or reduce resistance to current antitumor drugs, a bioprospecting study of the microalgae of the Cuatro Cienegas Basin (CCB), an oasis in the Chihuahuan desert in Mexico was conducted. A microalgae was identified as Granulocystopsis sp. through sequencing the rbcL gene and reconstruction of a phylogenetic tree, and its anticancer activities were assessed using various in vitro assays and different cell lines of human cancers, including lung, skin melanoma, colorectal, breast and prostatic cancers, as well as a normal cell line. The values of IC50 of the microalgae methanolic extract using the MTT assay were lower than 20 μg/ml, except that in the lung cancer line and the normal cell line. In vitro, the microalgae extract caused the loss of membrane integrity, monitored by the trypan blue exclusion test and exhibited marked inhibition of adhesion and cell proliferation in cancer cell lines, through the evaluation of the clonogenic assay. Also, typical nuclear changes of apoptotic processes were observed under the microscope, using the dual acridine orange/ethidium bromide fluorescent staining. Finally, the microalgae extract increased the activity of caspases 3 and 7 in skin melanoma, colon, breast and prostate cancer cells, in the same way as the apoptotic inductor and powerful antitumoral drug, doxorubicin. This study shows the anticancer activity from Granulocystopsis sp., a microalgae isolated from the CCB