Avaliação de compostos isolados da espécie do Cerrado Clusia pernambucensis G. Mariz em Leishmania (Leishmania) amazonensis

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2012.A leishmaniose tegumentar, causada por protozoários do gênero Leishmania, é uma doença endêmica que provoca lesões destrutivas e persistentes na pele e mucosas. Os medicamentos disponíveis apresentam toxicidade considerável e observa-se o crescente aparecimento de resistência medicamentosa, o que demonstra a necessidade da busca por compostos mais específicos para tratar esse agravo. A investigação do potencial de substâncias naturais se mostra uma abordagem eficiente, inclusive como parâmetro para a obtenção de compostos semi-sintéticos e sintéticos. Neste estudo, foi testada a atividade leishmanicida in vitro dos extratos das espécies do bioma Cerrado Austroplenckia populnea (Reissek) Lundell (Celastraceae); Clusia pernambucensis G. Mariz (Clusiaceae) e Maprounea guianensis Aubl. (Euphorbiaceae) entre 100 e 1,56 g/mL em formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. O extrato acetato de etila da casca do caule de Clusia pernambucensis apresentou atividade com CI50 = 65,0 µg/mL, e a menor citotoxicidade observada em fibroblastos da linhagem celular NIH-3T3, com CC50 = 100,5 µg/mL, sendo selecionado para os estudos químicos. O fracionamento desse extrato por cromatografia em coluna e CLAE permitiu o isolamento de sete substâncias, identificadas por espectroscopia de infravermelho, ressonância magnética nuclear 1H e 13C e espectrometria de massas de alta resolução. Foi isolada e caracterizada uma xantona ainda não relatada na literatura, 6,9-dihidróxi-3,3-dimetil-5-(3-metilbut-2-enil)pirano[2,3-c]xanten-7(3H), denominada pelo nosso grupo de clusiaxantona (CP1). Esse composto apresentou CI50 = 25,3 µg/mL em formas amastigotas de L. (L.) amazonensis no interior de macrófagos peritoneais coletados de camundongos Balb/C, enquanto seu derivado semi-sintético metil éter (1a) obteve CI50 = 22,5 µg/mL. Quatro tocotrienóis ainda não descritos nessa espécie também foram isolados e identificados: ácido Z-?-tocotrienolóico (CP2), ?- tocotrienol (CP3), ?-tocotrienol-metil-éster (CP4), e álcool ?-tocotrienólico (CP5). Os compostos CP3 e CP4 foram isolados pela primeira vez de fonte natural. Em relação a atividade em macrófagos murinos infectados com L. (L.) amazonensis, o ácido Z-?-tocotrienolóico (CP2) mostrou CI50 = 77,3 µg/mL, enquanto que o seu derivado metilado (2a) e os compostos CP3, CP4 e CP5 não apresentaram ação leishmanicida. O ácido betulínico (CP6) e o ?-sitosterol (CP7) também foram isolados. A citoxicidade em macrófagos murinos mostrou CC50 = 17,22 µg/mL para a clusiaxantona (CP1), 32,56 µg/mL para o derivado 1a e 78,04 µg/mL para o ?-tocotrienol-metil-éster (CP4). Outros derivados serão propostos para diminuir a citoxicidade e aumentar a atividade leishmanicida. Os compostos isolados e já caracterizados servirão como base para avançar na busca por candidatos a compostos líderes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTCutaneous leishmaniasis, caused by protozoa of the genus Leishmania, is na endemic disease that causes detructive and persistente lesions in skin and musoux. The available drugs presente significant toxicity and the increasing drug resistance is observed, which demonstrates the need to search for more specific compunds to treat this disease. The investigation of the potential of natural substances shows itself na eficiente approach, including as a parameter jfor obtaining semi-synthetic and synthetic compounds. In this study, we tested the in vitro leishmanicidal activity of extracts from species of the Cerrado biome Austropenckia populnea (Reissek) Lundell (Celastraceae); Clusia Pernambucensis G. Mariz (Clusiaceae) and Maprounea guianensis Aubl. (Euphorbikaceae) between 100 and 1.56 µg /mL in promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonenses. The ethyl acetate extract of the stem bark of Clusia pernambucensis, showed leishmanicidal activity with IC 50=65.0 µg /mL, and the lowest cytotoxicity observed in NIH-3T3 cell line fibrobasts with CC50=100.5 µg /mL, being selected for chemical studies. Fractionation of this extract by column chromatography and HPCL allowed the isolation of seven substances, identified with infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance 1H and 13C NMR and high-resolution mass spectrometry. It was isolated and characterized one xanthone not yet reported in the literature, 6,9-dihydroxy-3, 3-dimethyl-5-(3-methylbut-2enyl) pyrano[2,3-c]xanthen-7(3H), named clusiaxanthone (CP1) by our group. This compound showed IC50=25.3 µg /mL in amastigotes of L. (L.) amazonenses within peritoneal macrophages harvested from Balb/C mice, while its methyl ether semi-synthetic derivativa (1a) obteined IC50=22.5 µg /mL. Four tocotrienoloic not yet described in this specie were also isolated and identified: Z-?-tocotrienoloic acid (CP2), ?-tocotrienol (CP3), ?-tocotrienol-methyl-ester (CP4), and alcohol-? Tocotrienolic (CP5). The compound CP3 and CP4 were furst usikated from a natural source. Regarding the activity in murine macrophages infected with L. (l) amazonenses, the Z-?-tocotrienoloic acid (CP2) showed IC50=77.3 0 µg =/mL, whereas its semi-synthetic methylated derivative 2a and the compound CP3, CP4 and CP5 did not show anti-leishmanial activity. Betulinic acid (CP6) and β-sitosterol (CP7) were also isolated. The cytotoxicity in murine macrophages showed CC50=17.22 ug/mL for clusiaxanthone (CP1), 32.56 µg /mL for the derivative 1a and 78.04 µg /mL for the ?-tocotrienol-methyl ester (CP4). Other derivatives will be proposed to decrease cytotoxicity and increase the leishmanicidal activity. The compounds isolated and already characterized will serve as the basis for progress in the search for candidate lead compounds

Ação inibitória de extratos de plantas do Cerrado sobre α-amilases com ênfase em Kielmeyera coriacea

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2008.As α-amilases são enzimas digestivas amplamente distribuídas em microrganimos, plantas e animais, que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 e atuam no metabolismo de carboidratos. A inibição de α-amilases pode ser aplicada no controle de insetos-praga dependentes de dieta rica em amido para obtenção de energia, reduzindo a quantidade de nutrientes para evitar seu desenvolvimento. Essa ação permite o uso desses inibidores como bioinseticidas. A inibição da captação de carboidratos na saúde humana pode ser uma alternativa terapêutica no controle glicêmico, reduzindo picos de glicose pós-prandial no tratamento de doenças crônicas, tais como diabetes, obesidade e hiperlipidemia. Este projeto propõe a prospecção de moléculas ativas sobre as α- amilases. Nesse contexto, as plantas são fontes ricas em compostos que possam ser estudados. Assim, o potencial biológico do Banco de Extratos de Plantas do Bioma Cerrado, do Laboratório de Farmacognosia da Universidade de Brasília, foi avaliado sobre α-amilases de Acanthoscelides obtectus, Zabrotes subfasciatus e α-amilase salivar humana. Foram testados cento e oitenta e cinco extratos vegetais hexânicos, diclorometânicos, etanólicos e hidroetanólicos pertencentes a vinte e quatro espécies de dez famílias. O extrato hidroetanólico da casca do caule de Kielmeyera coriacea foi selecionado para estudo químico-biológico devido ao seu forte perfil inibitório, com IC50 110,00 µg.mL-1 e 272,12 µg.mL-1 sobre α-amilases de Z. subfasciatus e de A. obtectus, respectivamente. O extrato apresentou 97,09% de inibição sobre a isoforma humana a 125 µg.mL-1. A parttição líquido-líquido forneceu duas fazses com alto potencial inibitório, a fase 1, precipitado metanol/hexano, que inibiu 96,35%, e a fase 5, metanol/água, que apresentou 99,35% de inibição a 125 µg.mL-1. O fracionamento químico da fase 1 em coluna cromatográfica aberta de sephadex LH-20 permitiu a obtenção de 11 grupos. Dentre esses, os mais ativos sobre α-amilase humana foram o grupo 10 (95,24%) e o grupo 11 (99,00%). O conteúdo de fenóis totais e taninos foi analisado para o extrato bruto, fases e grupos ativos. A fase 1 demonstrou um forte teor de compostos fenólicos, com 1 mg.mL-1, sendo 53,56% de taninos e a fase 5 apresentou 0,95 mg.mL-1 de polifenóis, dos quais 35,96% são taninos. O grupo 11 mostrou 81,03% de constituintes taninos e inibiu 82% da α-amilase salivar humana a apenas 50 µg.mL-1. A avaliação de extratos e taninos sobre α-amilases demonstraram atividade promissora na inibição de captação de carboidratos, representando uma alternativa para o controle do diabetes e obesidade, assim como um potencial bem interessante na inibição de α- amilases de insetos. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACTα-amylases are digestive enzymes widely distributed in microrganims, plants and animals, that catalyze hidrolysis of α-1,4 glicosidic bonds and act in carbohydrate metabolism. The inhibition of α-amylases can be applied on control of insect pests that depends on starch-rich diet to energy production, reducing the amount of nutrients to avoid its development. This action allow the use of these inhibitors like bio-insecticides. The inhibition of carbohydrate uptake in human health could be an alternative therapeutic on glicemic control, reducing post-prandial glucose peaks in chronic diseases treatment, such as diabetes, obesity an hyperlipidaemia. This project purposes the prospection of active molecules. In this context, plants are rich sources of compounds that could be studied. Then, the biologic potential of Cerrado Biome Plant Extract Bank, of University of Brasilia Pharmacognosy Laboratory, was evaluated on Acanthoscelides obtectus α-amylases, Zabrotes subfasciatus α-amylases and human saliva α-amylase. One hundred eighty-five hexanic, dichlorometanic, ethanolic and hidro-ethanolic extracts belonging to twenty-four species from ten families. The hidroethanolic bark stem extract of Kielmeyera coriacea was selected to chemical-biological study because of its strong inhibitory profile, with IC50 110,00 µg.mL-1 and 272,12 µg.mL-1 towards Z. subfasciatus and A. obtectus α-amylases, respectively. The extract presented 97,09% of inhibition of human isoform at 125 µg.mL-1. The liquid-liquid partition yielded two phases with a great inhibitory potential, phase 1, methanol/hexan precipitated, that inhibited 96,35%, and phase 5, methanol/water, that presented 99,35% of inhibition at 125 µg.mL-1. The chemical frationation of fase 1 in open chromatographic sephadex LH-20 column alowed the separation of 11 groups. Among them, the most active on human α-amylase were group 10 (95,24%) and group 11 (99,00%). The content of total phenols and tannins was analysed to crude extract, phases and active groups. Phase 1 demonstrated a high teor of phenolic compounds, with 1 mg.mL-1, including 53,56% of tannins and phase 5 showed 0,95 mg.mL-1 of polyphenols content, in wich 35,96% are tannins. Group 11 showed 81,03% of tannins content which inhibited 82% of human saliva α-amylase at only 50 µg.mL-1. The evaluation of extracts and tannins on α-amylases demonstrated a promising activity in carbohydrate uptake inhibition, representing a alternative to control diabetes and obesity, as well as a really interesting potential to insects α-amylases inhibition.</p

Encapsulated Brucella ovis Lacking a Putative ATP-Binding Cassette Transporter (ΔabcBA) Protects against Wild Type Brucella ovis in Rams.

Submitted by Nuzia Santos ([email protected]) on 2016-04-05T16:46:49Z No. of bitstreams: 1 Encapsulated Brucella(...) Transporte.pdf: 3817674 bytes, checksum: fc75361cde3ac21b6b485230614c7a04 (MD5)Approved for entry into archive by Nuzia Santos ([email protected]) on 2016-04-05T16:56:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Encapsulated Brucella(...) Transporte.pdf: 3817674 bytes, checksum: fc75361cde3ac21b6b485230614c7a04 (MD5)Made available in DSpace on 2016-04-05T16:56:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Encapsulated Brucella(...) Transporte.pdf: 3817674 bytes, checksum: fc75361cde3ac21b6b485230614c7a04 (MD5) Previous issue date: 2015Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Patologia Geral. Belo Horizonte, MG, BrazilUniversidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Patologia Geral. Belo Horizonte, MG, BrazilUniversidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Patologia Geral. Belo Horizonte, MG, BrazilUniversidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Patologia Geral. Belo Horizonte, MG, BrazilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Estadual do Maranhão. Departamento de Patologia. São Luís, MA, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilEmpresa Brasileira de Agropecuária. Juiz de Fora, MG, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Patologia Geral. Belo Horizonte, MG, BrazilUniversidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. Belo Horizonte, MG, BrasilThis study aimed to evaluate protection induced by the vaccine candidate B. ovis ΔabcBA against experimental challenge with wild type B. ovis in rams. Rams were subcutaneously immunized with B. ovis ΔabcBA encapsulated with sterile alginate or with the non encapsulated vaccine strain. Serum, urine, and semen samples were collected during two months after immunization. The rams were then challenged with wild type B. ovis (ATCC25840), and the results were compared to non immunized and experimentally challenged rams. Immunization, particularly with encapsulated B. ovis ΔabcBA, prevented infection, secretion of wild type B. ovis in the semen and urine, shedding of neutrophils in the semen, and the development of clinical changes, gross and microscopic lesions induced by the wild type B. ovis reference strain. Collectively, our data indicates that the B. ovis ΔabcBA strain is an exceptionally good vaccine strain for preventing brucellosis caused by B. ovis infection in rams

Frequency of isolation of wild type <i>Brucella ovis</i> from semen (A) and urine (B); or PCR detection in semen (C) or urine (D) samples, before and after challenge.

<p>The number of weeks is indicated in the x axis.</p

Frequency of seropositive rams (non immunized or immunized with encapsulated or non encapsulated <i>Brucella ovis</i> Δ<i>abcBA</i>).

<p>Seropositivity was determined by agar gel immune diffusion (AGID) before and after challenge. The number of weeks before and after challenge is indicated in the x axis. Statistical differences between groups (10 rams per group) are indicated by asterisks (**p<0.01; *** p<0.001).</p

Microscopic changes in the reproductive system of non immunized rams experimentally challenged with <i>Brucella ovis</i>, at 8 weeks post challenge.

<p>Severe neutrophilic epididymitis associated to cystic epithelium degeneration (black arrow), with positive immunestaining for <i>B</i>. <i>ovis</i> (inset, 100X) in the tail of the epididymis from a non immunized ram (A). Tail of the epididymis from a ram immunized with encapsulated <i>B</i>. <i>ovis</i> Δ<i>abcBA</i> and challenged with wild type <i>B</i>. <i>ovis</i> with no histological changes (B). Moderate lympho-histiocytic and neutrophilic inflammatory infiltrate in the ampullae of a non immunized ram (C). Absence of histological changes in the ampullae of a ram immunized with encapsulated <i>B</i>. <i>ovis</i> Δ<i>abcBA</i> and challenged with wild type <i>B</i>. <i>ovis</i> (D), H. E. Bar = 50 μm.</p

Frequency of isolation (A) or PCR detection (B) of wild type <i>Brucella ovis</i> in tissues from non immunized rams or rams immunized with encapsulated or non encapsulated <i>Brucella ovis</i> Δ<i>abcBA</i> at eight weeks post experimental challenge with wild type <i>B</i>. <i>ovis</i>.

<p>Frequency of isolation (A) or PCR detection (B) of wild type <i>Brucella ovis</i> in tissues from non immunized rams or rams immunized with encapsulated or non encapsulated <i>Brucella ovis</i> Δ<i>abcBA</i> at eight weeks post experimental challenge with wild type <i>B</i>. <i>ovis</i>.</p

Peripheral blood leukocyte immunophenotyping of non immunized rams, and rams immunized with encapsulated or non encapsulated <i>B</i>. <i>ovis</i> Δ<i>abcBA</i>.

<p>Samples were obtained prior to immunization, 1 and 4 weeks after immunization, and 1 and 4 weeks after challenge. (A) CD4⁺ T lymphocytes, (B) CD8⁺ T lymphocytes, (C) γ/Δ T lymphocytes, and (D) B lymphocytes. The number of weeks before and after challenge is indicated in the x axis. Data represents mean and standard error.</p