Die NMR-Lösungsstruktur des Calmodulin-C20W-Komplexes

In der vorliegenden Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur des CaM/C20W­ Komplexes mit Hilfe von heteronuklearer, mehrdimensionaler NMR­Spektroskopie ermittelt. Der stabile CaM/C20W­Komplex mit einer Bindungskonstanten KD = 11 nM besteht aus dem Protein CaM und dem Peptid C20W. CaM, ein kleines, saures Protein (16,7 kDa), das in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und hantelförmig mit zwei Domänen aufgebaut ist, übermittelt die Signalwirkung von Calciumionen an eine Reihe von Zielenzymen. Durch die Bindung von CaM an die Plasmamembran Ca 2 ­ATPase wird das Calciumsignal wieder beendet. Das Peptid C20W entspricht dem N­terminalen Teil der Calmodulin­Bindungsdomäne der Ca 2 ­ATPase. Röntgenkleinwinkelstreu­ experimente an dem CaM/C20W­Komplex führten zu der Vermutung, daß das Peptid C20W nur an die C­terminale Domäne von CaM bindet und damit einen unterschiedlichen Bindungsmodus im Gegensatz zu den bekannten Calmodulin­ bindenden Peptiden zeigt. Zur Strukturbestimmung des CaM/C20W­Komplexes wurde eine Probe aus 13 C, 15 N­markiertem CaM und unmarkiertem C20W verwendet. Diese unterschiedliche Markierungsweise erlaubt die Unterscheidung beider Komponenten in den NMR­ Spektren. Für CaM wurden eine Serie von heteronuklearen, dreidimensionalen Tripelresonanzexperimente aufgenommen, die zunächst die Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats und dann auch der der Seitenketten erlaubte. Spezielle NMR­ Experimente wurden für die Zuordnung der neun Methionine durchgeführt, die bei der Bindung des Peptids eine wichtige Rolle spielen. Durch die Auswertung von NOESY Spektren wurden 1645 Abstands­restraints für CaM ermittelt, die sich in 794 intraresiduale, 387 sequentielle, 311 mittelreichweitige und 153 langreichweitige restraints aufteilen. Durch die Bestimmung der Temperaturkoeffizienten der Amidprotonen konnten 52 Wasserstoffbrücken von CaM zugeordnet werden. Durch doppeltgefilterte, homonukleare Korrelationsexperimente, bei denen die Protonen­ resonanzen von 13 C, 15 N­markiertem CaM unterdrückt werden, konnten die Resonanzen des unmarkierten Peptids C20W zugeordnet werden. Es wurden 163 NOE restraints ermittelt, wobei 102 intraresidual, 32 sequentiell und 29 mittelreichweitig waren. Schließlich konnten mit Hilfe eines halbgefilterten NOESY­Experiments 49 intermolekulare NOE's zwischen CaM und C20W zugeordnet werden. Außerdem wurden neben den Abstands­restraints für CaM 129 Dihedralwinkel­restraints ermittelt. Die gesamte Zuordnung des CaM/C20W­Komplexes wurde in der Datenbank BioMagResBank mit der Nummer 4284 abgelegt (http://www.bmrb.wisc.edu/). Die experimentell gewonnenen restraints wurden in einer Moleküldynamik­Rechnung mit einem simulated annealing­Protokoll verwendet, wobei insgesamt 200 Strukturen berechnet wurden. Die 26 energieärmsten Strukturen wurden als repräsentativ ausgewählt und in der Brookhaven Protein Datenbank mit dem PDB ID­Code 1CFF abgelegt (http://www.rcsb.org/). Die 26 Strukturen weisen für die N­terminale Domäne einen RMSD­Wert von 0.75 Å über die Proteinrückgratatome und für die C­terminale Domäne zusammen mit dem Peptid C20W einen RMSD­Wert von 0.53 Å über die Proteinrückgratatome auf. Die hohe Konvergenz der Strukturen und gute Werte bei der Ramachandran­Statistik (73.7% in den erlaubten Bereichen) sprechen für eine gute Qualität der ermittelten Strukturen. Die ermittelte Struktur des CaM/C20W­Komplexes zeigte einen neuartigen Bindungsmodus des Peptids. C20W bindet nur an die C­terminale Domäne von CaM, die N­terminale Domäne ist nicht in der Bindung involviert. Diese Struktur steht damit im Gegensatz zu den bisher bekannten CaM/Peptid­Komplexen, bei denen das Peptid von beiden Domänen gebunden wird und ein globulärer Komplex entsteht. Der Bindungsmodus des C20Ws wurde zum einen durch chemische Verschiebungs­ differenzen der Amidprotonen und der Methionine ermittelt. Zum anderen konnten ausgehend von C20W intermolekulare NOE's nur zur C­terminalen Domäne von CaM zugeordnet werden. Die Sekundärstruktur von CaM ändert sich durch die Bindung des Peptids kaum. Beide Domänen, die zueinander homolog sind, bestehen aus vier alpha­Helices und einem kurzen antiparallelen beta­Faltblatt. Verbunden sind beide Domänen durch eine flexiblen Linkerbereich, wobei die Domänen zueinander keine Orientierung zeigen, da keine NOE's zwischen den Domänen gefunden wurden. Der ungewöhnliche Bindungsmodus des Peptids C20W steht im Einklang mit der Tatsache, daß die Plasmamembran Ca 2 ­ATPase bereits durch die C­terminale Domäne von CaM aktiviert werden kann. Der CaM/C20W­Komplex läßt sich daher als Schnappschuß auf dem Weg der vollständigen Aktivierung der Ca 2 ­ATPase durch CaM verstehen. Die Ergebnisse der NMR­spektroskopischen Untersuchung des CaM/C20W­Komplexes wurden in (1999) Biochemistry 38, 12320­12332 veröffentlicht. Die Publikation ist im Anhang (Kapitel 6.9) beigefügt. Um die Orientierung der Domänen des CaM/C20W­Komplexes zueinander zu untersuchen, sind weiterführende Experimente geplant. Hierzu sollen Messungen an einem CaM/C20W­Komplex unternommen werden, der am N­Terminus des Peptids einen paramagnetischen Marker trägt, wobei dipolare Kopplungen und Pseudo­ kontaktshifts ermittelt werden sollen. Weiterhin sind ähnliche Untersuchungen an einem CaM/C20W­Komplex geplant, der am N­Terminus von CaM einen paramagnetischen Marker trägt. Mit diesen Experimenten sollte es gelingen, die Frage der Domänen­ orientierung zu klären

Der selektive Cyclooxygenase-2-Inhibitor Celecoxib ist ein sicheres Ausweichpräparat bei Patienten mit Intoleranzen gegenüber nicht-steroidalen Antiphlogistika

Fragestellung Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika sind häufig und basieren auf der Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase-1 (COX-1), wohingegen deren therapeutische Effekte auf einer COX-2 Hemmung beruhen. In dieser Studie wurde die Verträglichkeit des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib bei Patienten mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika untersucht. Methodik Bei 77 Patienten (24 Männer, 53 Frauen) mit Intoleranzreaktionen auf nicht-steroidale Antiphlogistika wurden standardisierte Hauttestungen (Prick, Scratch, Epikutantestung) sowie anschließend orale fraktionierte Placebo-kontrollierte einfach blinde Expositionstestungen unter Einschluß von Celecoxib (maximale Einzeldosis 200mg, kumukative Tagesdosis 350mg) durchgeführt. Ergebnisse 21 Patienten wiesen anamnestisch lediglich Hautsymptome (Urtikaria) auf, 25 Patienten nur eine Atemwegssymptomatik (Asthma), bei 18 Patienten traten Haut- und Atemwegssymptome auf, und bei 13 Patienten war es zu einem anaphylaktischen Schock gekommen. Azetylsalizylsäure war in 38 Fällen ein Auslöser der Beschwerden. In 46 Fällen verursachten mehrere nicht-steroidale Antiphlogistika chemisch unterschiedlicher Gruppen die Symptomatik. Die orale Expositionstestung mit Celecoxib verlief bei allen 77 Patienten unauffällig. Schlußfolgerung Vor dem Hintergrund der hohen Inzidenz von Intoleranzreaktionen gegen nicht-steroidale Antiphlogistika stellt der Einsatz selektiver COX-2 Inhibitoren eine therapeutische Alternative sowie eine geeignete Maßnahme zur Prävention entsprechender Reaktionen dar

A Score of the Ability of a Three-Dimensional Protein Model to Retrieve Its Own Sequence as a Quantitative Measure of Its Quality and Appropriateness

BACKGROUND: Despite the remarkable progress of bioinformatics, how the primary structure of a protein leads to a three-dimensional fold, and in turn determines its function remains an elusive question. Alignments of sequences with known function can be used to identify proteins with the same or similar function with high success. However, identification of function-related and structure-related amino acid positions is only possible after a detailed study of every protein. Folding pattern diversity seems to be much narrower than sequence diversity, and the amino acid sequences of natural proteins have evolved under a selective pressure comprising structural and functional requirements acting in parallel. PRINCIPAL FINDINGS: The approach described in this work begins by generating a large number of amino acid sequences using ROSETTA [Dantas G et al. (2003) J Mol Biol 332:449-460], a program with notable robustness in the assignment of amino acids to a known three-dimensional structure. The resulting sequence-sets showed no conservation of amino acids at active sites, or protein-protein interfaces. Hidden Markov models built from the resulting sequence sets were used to search sequence databases. Surprisingly, the models retrieved from the database sequences belonged to proteins with the same or a very similar function. Given an appropriate cutoff, the rate of false positives was zero. According to our results, this protocol, here referred to as Rd.HMM, detects fine structural details on the folding patterns, that seem to be tightly linked to the fitness of a structural framework for a specific biological function. CONCLUSION: Because the sequence of the native protein used to create the Rd.HMM model was always amongst the top hits, the procedure is a reliable tool to score, very accurately, the quality and appropriateness of computer-modeled 3D-structures, without the need for spectroscopy data. However, Rd.HMM is very sensitive to the conformational features of the models' backbone

Evaluation de nouvelles molécules nitro-imidazolées de synthèse sur Trichomonas Vaginalis

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