Iron acquisition in Bacillus cereus: the roles of IlsA and bacillibactin in exogenous ferritin iron mobilization

9siIn host-pathogen interactions, the struggle for iron may have major consequences on the outcome of the disease. To overcome the low solubility and bio-availability of iron, bacteria have evolved multiple systems to acquire iron from various sources such as heme, hemoglobin and ferritin. The molecular basis of iron acquisition from heme and hemoglobin have been extensively studied; however, very little is known about iron acquisition from host ferritin, a 24-mer nanocage protein able to store thousands of iron atoms within its cavity. In the human opportunistic pathogen Bacillus cereus, a surface protein named IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein type A) binds heme, hemoglobin and ferritin in vitro and is involved in virulence. Here, we demonstrate that IlsA acts as a ferritin receptor causing ferritin aggregation on the bacterial surface. Isothermal titration calorimetry data indicate that IlsA binds several types of ferritins through direct interaction with the shell subunits. UV-vis kinetic data show a significant enhancement of iron release from ferritin in the presence of IlsA indicating for the first time that a bacterial protein might alter the stability of the ferritin iron core. Disruption of the siderophore bacillibactin production drastically reduces the ability of B. cereus to utilize ferritin for growth and results in attenuated bacterial virulence in insects. We propose a new model of iron acquisition in B. cereus that involves the binding of IlsA to host ferritin followed by siderophore assisted iron uptake. Our results highlight a possible interplay between a surface protein and a siderophore and provide new insights into host adaptation of B. cereus and general bacterial pathogenesis.openopenSegond D; Abi Khalil E; Buisson C; Daou N; Kallassy M; Lereclus D; Arosio P; Bou-Abdallah F; Nielsen Le Roux C.Segond, D; Abi Khalil, E; Buisson, C; Daou, N; Kallassy, M; Lereclus, D; Arosio, Paolo; Bou Abdallah, F; Nielsen Le Roux, C

Mécanismes d’acquisition du fer chez Bacillus cereus : rôles d’IlsA, du système Isd et des sidérophores dans l’assimilation du fer à partir de l’hème et de la ferritine

In host-pathogen interactions, the struggle for iron may have major consequences on the outcome of the disease. To overcome the limited iron bioavailability in the host, bacteria have developed several strategies to acquire iron during infection. In the human opportunistic bacteria Bacillus cereus, a particular NEAT-LRR domain protein named IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein) was previously identified as a surface protein involved in iron acquisition from both hemoproteins and ferritin. In this study, we characterized the function of IlsA and the IlsA-NEAT domain and their involvement in heme and hemoglobin binding. Our results show that IlsA binds heme via the NEAT domain with a 1:1 stoichiometry and that this domain is able to extract heme from hemoglobin. Furthermore, the dynamic interplay between IlsA and the B.cereus Isd system (Iron surface determinant) involved in heme acquisition in other Gram-positive bacteria has been investigated. Following direct protein-protein interaction, we observe a heme transfer from holo-IlsA to apo-IsdC.The molecular basis of iron assimilation from host-ferritin by pathogens remains largely unknown. Here, we show that IlsA interacts directly with several forms of ferritins, causing ferritin aggregation on the bacterial surface, leading to an increase in iron release from the ferritin nanocages. In addition, the binding stoichiometry of 24 IlsA for 1 ferritin evidence an interaction between IlsA and each subunit of the ferritin shell. Finally, a B. cereus strain disrupted in bacillibactin production was markedly affected both in ferritin acquisition and in virulence in an insect model, suggesting a possible partnership between siderophores and IlsA in iron uptake from ferritin. Globally, this study highlights the interplay between surface proteins and siderophores and provides new insight into host adaptation of B. cereus.Key words: Iron, Bacillus cereus, IlsA, NEAT, IsdC, heme, hemoglobin, ferritins, siderophore.Au cours des interactions hôte-pathogène, la lutte pour le fer peut conditionner l'évolution de l'infection. Afin de s'adapter à la faible quantité de fer libre présente chez l'hôte, les bactéries ont développé diverses stratégies leur permettant d'acquérir cet élément vital. Chez Bacillus cereus, une bactérie pathogène opportuniste de l'homme, la protéine IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein), qui contient entre autres des domaines NEAT et LRR, a été identifiée. Il s'agit d'une protéine de surface impliquée dans l'acquisition du fer des hémoprotéines et de la ferritine. Dans un premier temps, nous avons caractérisé la fonction d'IlsA et de son domaine NEAT ainsi que leur implication dans la liaison à l'hème et l'hémoglobine. Nos résultats indiquent qu'IlsA capte l'hème via son domaine NEAT avec une stœchiométrie 1:1 et que ce domaine est capable d'extraire l'hème de l'hémoglobine. Par ailleurs, l'interaction entre IlsA et IsdC, une des protéines du système Isd (Iron surface determinant) décrit chez d'autres bactéries à Gram-positif, a été analysée. Suite à un contact direct entre ces deux protéines, nous avons démontré que l'hème était transféré d'holo-IlsA vers apo-IsdC. Dans un second temps, nous avons étudié les mécanismes permettant l'assimilation du fer à partir de la ferritine. Nous avons ainsi montré qu'IlsA pouvait interagir avec plusieurs types de ferritine avec une stœchiométrie de 24 molécules d'IlsA pour une ferritine. Ceci suggère qu'IlsA se lie à chaque sous-unité de la ferritine. De plus, en présence de sidérophores, cette interaction conduit à une augmentation de la libération du fer contenu dans la ferritine. Finalement, une souche de B. cereus qui ne produit plus de bacillibactine, un des deux sidérophores synthétisés par cette bactérie, n'est plus capable d'utiliser la ferritine comme source de fer pour sa croissance. De plus, sa virulence chez l'insecte est atténuée. Ces données indiquent qu'IlsA et la bacillibactine sont toutes les deux impliquées dans l'acquisition du fer de la ferritine. Ces travaux mettent donc en évidence l'interaction qui existe entre IlsA et les protéines de surface d'une part et les sidérophores d'autre part. Ils apportent également de nouveaux éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation mis en œuvre chez l'hôte par B. cereus.Mots clés : Fer, Bacillus cereus, IlsA, NEAT, IsdC, hème, hémoglobine, ferritine, sidérophore

Mécanismes d’acquisition du fer chez Bacillus cereus : rôles d’IlsA, du système Isd et des sidérophores dans l’assimilation du fer à partir de l’hème et de la ferritine

In host-pathogen interactions, the struggle for iron may have major consequences on the outcome of the disease. To overcome the limited iron bioavailability in the host, bacteria have developed several strategies to acquire iron during infection. In the human opportunistic bacteria Bacillus cereus, a particular NEAT-LRR domain protein named IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein) was previously identified as a surface protein involved in iron acquisition from both hemoproteins and ferritin. In this study, we characterized the function of IlsA and the IlsA-NEAT domain and their involvement in heme and hemoglobin binding. Our results show that IlsA binds heme via the NEAT domain with a 1:1 stoichiometry and that this domain is able to extract heme from hemoglobin. Furthermore, the dynamic interplay between IlsA and the B.cereus Isd system (Iron surface determinant) involved in heme acquisition in other Gram-positive bacteria has been investigated. Following direct protein-protein interaction, we observe a heme transfer from holo-IlsA to apo-IsdC.The molecular basis of iron assimilation from host-ferritin by pathogens remains largely unknown. Here, we show that IlsA interacts directly with several forms of ferritins, causing ferritin aggregation on the bacterial surface, leading to an increase in iron release from the ferritin nanocages. In addition, the binding stoichiometry of 24 IlsA for 1 ferritin evidence an interaction between IlsA and each subunit of the ferritin shell. Finally, a B. cereus strain disrupted in bacillibactin production was markedly affected both in ferritin acquisition and in virulence in an insect model, suggesting a possible partnership between siderophores and IlsA in iron uptake from ferritin. Globally, this study highlights the interplay between surface proteins and siderophores and provides new insight into host adaptation of B. cereus.Key words: Iron, Bacillus cereus, IlsA, NEAT, IsdC, heme, hemoglobin, ferritins, siderophore.Au cours des interactions hôte-pathogène, la lutte pour le fer peut conditionner l'évolution de l'infection. Afin de s'adapter à la faible quantité de fer libre présente chez l'hôte, les bactéries ont développé diverses stratégies leur permettant d'acquérir cet élément vital. Chez Bacillus cereus, une bactérie pathogène opportuniste de l'homme, la protéine IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein), qui contient entre autres des domaines NEAT et LRR, a été identifiée. Il s'agit d'une protéine de surface impliquée dans l'acquisition du fer des hémoprotéines et de la ferritine. Dans un premier temps, nous avons caractérisé la fonction d'IlsA et de son domaine NEAT ainsi que leur implication dans la liaison à l'hème et l'hémoglobine. Nos résultats indiquent qu'IlsA capte l'hème via son domaine NEAT avec une stœchiométrie 1:1 et que ce domaine est capable d'extraire l'hème de l'hémoglobine. Par ailleurs, l'interaction entre IlsA et IsdC, une des protéines du système Isd (Iron surface determinant) décrit chez d'autres bactéries à Gram-positif, a été analysée. Suite à un contact direct entre ces deux protéines, nous avons démontré que l'hème était transféré d'holo-IlsA vers apo-IsdC. Dans un second temps, nous avons étudié les mécanismes permettant l'assimilation du fer à partir de la ferritine. Nous avons ainsi montré qu'IlsA pouvait interagir avec plusieurs types de ferritine avec une stœchiométrie de 24 molécules d'IlsA pour une ferritine. Ceci suggère qu'IlsA se lie à chaque sous-unité de la ferritine. De plus, en présence de sidérophores, cette interaction conduit à une augmentation de la libération du fer contenu dans la ferritine. Finalement, une souche de B. cereus qui ne produit plus de bacillibactine, un des deux sidérophores synthétisés par cette bactérie, n'est plus capable d'utiliser la ferritine comme source de fer pour sa croissance. De plus, sa virulence chez l'insecte est atténuée. Ces données indiquent qu'IlsA et la bacillibactine sont toutes les deux impliquées dans l'acquisition du fer de la ferritine. Ces travaux mettent donc en évidence l'interaction qui existe entre IlsA et les protéines de surface d'une part et les sidérophores d'autre part. Ils apportent également de nouveaux éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation mis en œuvre chez l'hôte par B. cereus.Mots clés : Fer, Bacillus cereus, IlsA, NEAT, IsdC, hème, hémoglobine, ferritine, sidérophore

Mechanisms of iron acquisition in Bacillus cereus : roles of IlsA, the Isd system and the siderophores in iron assimilation from heme and ferritin

Au cours des interactions hôte-pathogène, la lutte pour le fer peut conditionner l'évolution de l'infection. Afin de s'adapter à la faible quantité de fer libre présente chez l'hôte, les bactéries ont développé diverses stratégies leur permettant d'acquérir cet élément vital. Chez Bacillus cereus, une bactérie pathogène opportuniste de l'homme, la protéine IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein), qui contient entre autres des domaines NEAT et LRR, a été identifiée. Il s'agit d'une protéine de surface impliquée dans l'acquisition du fer des hémoprotéines et de la ferritine. Dans un premier temps, nous avons caractérisé la fonction d'IlsA et de son domaine NEAT ainsi que leur implication dans la liaison à l'hème et l'hémoglobine. Nos résultats indiquent qu'IlsA capte l'hème via son domaine NEAT avec une stœchiométrie 1:1 et que ce domaine est capable d'extraire l'hème de l'hémoglobine. Par ailleurs, l'interaction entre IlsA et IsdC, une des protéines du système Isd (Iron surface determinant) décrit chez d'autres bactéries à Gram-positif, a été analysée. Suite à un contact direct entre ces deux protéines, nous avons démontré que l'hème était transféré d'holo-IlsA vers apo-IsdC. Dans un second temps, nous avons étudié les mécanismes permettant l'assimilation du fer à partir de la ferritine. Nous avons ainsi montré qu'IlsA pouvait interagir avec plusieurs types de ferritine avec une stœchiométrie de 24 molécules d'IlsA pour une ferritine. Ceci suggère qu'IlsA se lie à chaque sous-unité de la ferritine. De plus, en présence de sidérophores, cette interaction conduit à une augmentation de la libération du fer contenu dans la ferritine. Finalement, une souche de B. cereus qui ne produit plus de bacillibactine, un des deux sidérophores synthétisés par cette bactérie, n'est plus capable d'utiliser la ferritine comme source de fer pour sa croissance. De plus, sa virulence chez l'insecte est atténuée. Ces données indiquent qu'IlsA et la bacillibactine sont toutes les deux impliquées dans l'acquisition du fer de la ferritine. Ces travaux mettent donc en évidence l'interaction qui existe entre IlsA et les protéines de surface d'une part et les sidérophores d'autre part. Ils apportent également de nouveaux éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation mis en œuvre chez l'hôte par B. cereus.Mots clés : Fer, Bacillus cereus, IlsA, NEAT, IsdC, hème, hémoglobine, ferritine, sidérophore.In host-pathogen interactions, the struggle for iron may have major consequences on the outcome of the disease. To overcome the limited iron bioavailability in the host, bacteria have developed several strategies to acquire iron during infection. In the human opportunistic bacteria Bacillus cereus, a particular NEAT-LRR domain protein named IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein) was previously identified as a surface protein involved in iron acquisition from both hemoproteins and ferritin. In this study, we characterized the function of IlsA and the IlsA-NEAT domain and their involvement in heme and hemoglobin binding. Our results show that IlsA binds heme via the NEAT domain with a 1:1 stoichiometry and that this domain is able to extract heme from hemoglobin. Furthermore, the dynamic interplay between IlsA and the B.cereus Isd system (Iron surface determinant) involved in heme acquisition in other Gram-positive bacteria has been investigated. Following direct protein-protein interaction, we observe a heme transfer from holo-IlsA to apo-IsdC.The molecular basis of iron assimilation from host-ferritin by pathogens remains largely unknown. Here, we show that IlsA interacts directly with several forms of ferritins, causing ferritin aggregation on the bacterial surface, leading to an increase in iron release from the ferritin nanocages. In addition, the binding stoichiometry of 24 IlsA for 1 ferritin evidence an interaction between IlsA and each subunit of the ferritin shell. Finally, a B. cereus strain disrupted in bacillibactin production was markedly affected both in ferritin acquisition and in virulence in an insect model, suggesting a possible partnership between siderophores and IlsA in iron uptake from ferritin. Globally, this study highlights the interplay between surface proteins and siderophores and provides new insight into host adaptation of B. cereus.Key words: Iron, Bacillus cereus, IlsA, NEAT, IsdC, heme, hemoglobin, ferritins, siderophore

Iron Acquisition in Bacillus cereus: The Roles of IlsA and Bacillibactin in Exogenous Ferritin Iron Mobilization

In host-pathogen interactions, the struggle for iron may have major consequences on the outcome of the disease. To overcome the low solubility and bio-availability of iron, bacteria have evolved multiple systems to acquire iron from various sources such as heme, hemoglobin and ferritin. The molecular basis of iron acquisition from heme and hemoglobin have been extensively studied; however, very little is known about iron acquisition from host ferritin, a 24-mer nanocage protein able to store thousands of iron atoms within its cavity. In the human opportunistic pathogen Bacillus cereus, a surface protein named IlsA (Iron-regulated leucine rich surface protein type A) binds heme, hemoglobin and ferritin in vitro and is involved in virulence. Here, we demonstrate that IlsA acts as a ferritin receptor causing ferritin aggregation on the bacterial surface. Isothermal titration calorimetry data indicate that IlsA binds several types of ferritins through direct interaction with the shell subunits. UV-vis kinetic data show a significant enhancement of iron release from ferritin in the presence of IlsA indicating for the first time that a bacterial protein might alter the stability of the ferritin iron core. Disruption of the siderophore bacillibactin production drastically reduces the ability of B. cereus to utilize ferritin for growth and results in attenuated bacterial virulence in insects. We propose a new model of iron acquisition in B. cereus that involves the binding of IlsA to host ferritin followed by siderophore assisted iron uptake. Our results highlight a possible interplay between a surface protein and a siderophore and provide new insights into host adaptation of B. cereus and general bacterial pathogenesis. Author Summary Iron homeostasis is important for all living organisms; too much iron confers cell toxicity, and too little iron results in reduced cell fitness. While crucial for many cellular processes in both man and pathogens, a battle for this essential nutrient erupts during infection between the host and the invading bacteria. Iron is principally stored in ferritin, a large molecule able to bind several thousand iron ions. Although host ferritins represent a mine of iron for pathogens, studies of the mechanisms involved in its acquisition by bacteria are scarce. In the human opportunistic pathogen Bacillus cereus, the surface protein IlsA is able to bind several host iron sources in vitro. In this study, we show that IlsA acts as a ferritin receptor and enhances iron release from the ferritin through direct interaction with each ferritin subunit. Moreover, we demonstrate that the siderophore bacillibactin, a small secreted iron chelator, is essential for ferritin iron acquisition and takes part in B. cereus virulence. We propose a new iron acquisition model that provides new insights into bacterial host adaptation

Effects of siderophore deficiency on <i>B. cereus</i> virulence in <i>G. mellonella</i> are dose- and time-dependent.

<p>Wild type and mutant strains were injected separately into the hemocoel. For each strain, twenty last-instar larvae were infected with 3×10⁴ (<b>A</b>), 1×10⁴ (<b>B</b>) or 3×10³ (<b>C</b>) of mid-log phase bacteria. The survival rate (% of alive/total number of infected larvae) was monitored for 72 hours after infection with the wild type (black square), Δ<i>asb</i> (blue diamond), Δ<i>entA</i> (red triangle), <i>ΔentAΩentA</i> (purple triangle), Δ<i>entA</i>Δ<i>asb</i> (grey circle) strains or PBS (green cross). <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003935#s2" target="_blank">Results</a> are mean values of three to seven independent experiments and error bars indicate SEM from mean values. Based on these data, LD₅₀ were estimated and are reported in <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003935#ppat-1003935-t002" target="_blank">Table 2</a>. (<b>D</b>) Illustrates white alive and dead black larvae.</p

Schematic representation of iron uptake from ferritin in <i>B. cereus</i>.

<p>(1) In low iron environments, IlsA is produced and anchored to the surface. IlsA binds to each ferritin subunit, resulting in ferritin recognition and recruitment on the bacterial cell surface. (2) Following binding interaction, IlsA is proposed to alter ferritin pores openings or subunit-subunit interactions leading to protein destabilization or an increased accessibility to the ferritin iron core. (3) Because IlsA itself does not bind iron (data not shown), the iron released from ferritin by the action of IlsA is chelated by bacillibactin (and may involve other molecules) whereby the iron-siderophore complex is transported into the cell probably via the FeuA transporter leading to iron release into the cytosol.</p

Virulence of siderophore mutants in <i>G. mellonella.</i>

a<p>The 50% lethal doses, in number of colony forming units (cfu), were evaluated by Probit survival.</p><p>analysis (<i>p</i><0.05).</p

Best fit parameters for ITC measurements of IlsA binding to ferritins^a.

a<p>The reported thermodynamic quantities are apparent values and include the contributions to the overall equilibrium from ferritin and buffer species in different states of protonation.</p><p>Standard errors from replicate determinations are indicated.</p>b<p>Calculated from Δ<i>G</i>⁰ = −<i>RT</i>ln<i>K</i>.</p>c<p>Calculated from Δ<i>S</i>⁰ = (Δ<i>H</i>°−Δ<i>G</i>°)/<i>T</i>.</p><p>HuHF, recombinant human H-chain ferritin; HuLF, recombinant human L-chain ferritin; HuH/LF, recombinant heteropolymer ferritin of 21H-chains and 4L-chains; MoHF, recombinant mouse H-chain ferritin. All experiments were repeated two to four times.</p

Iron acquisition from ferritin relies on bacillibactin production.

<p>Growth kinetics of <i>B. cereus</i> wild type (WT; black square), Δ<i>asb</i> petrobactin mutant (blue triangle), Δ<i>entA</i> bacillibactin mutant (red circle), complemented <i>ΔentAΩentA</i> strains (purple diamond) and double Δ<i>entA</i>Δ<i>asb</i> mutant (grey cross). The strains were grown at 37°C in LB medium (<b>A</b>) and in LB medium treated with 2,2′-dipyridyl without addition of iron sources (<b>B</b>) or supplemented with 0.3 µM ferritin only (<b>C</b>) or with 0.3 µM ferritin and 5 µM enterobactin (<b>D</b>). Bacterial growth was monitored during 16 hours by measuring the optical density (OD) at 600 nm every hour. Curves are averages of three independent experiments and error bars are SEM from mean values.</p