Context-dependent T-cell Receptor Gene Repertoire Profiles in Proliferations of T Large Granular Lymphocytes

T cell large granular lymphocyte (T-LGL) lymphoproliferations constitute a disease spectrum ranging from poly/oligo to monoclonal. Boundaries within this spectrum of proliferations are not well established. T-LGL lymphoproliferations co-occur with a wide variety of other diseases ranging from autoimmune disorders, solid tumors, hematological malignancies, post solid organ, and hematopoietic stem cell transplantation, and can therefore arise as a consequence of a wide variety of antigenic triggers. Persistence of a dominant malignant T-LGL clone is established through continuous STAT3 activation. Using next-generation sequencing, we profiled a cohort of 27 well-established patients with T-LGL lymphoproliferations, aiming to identify the subclonal architecture of the T-cell receptor beta (TRB) chain gene repertoire. Moreover, we searched for associations between TRB gene repertoire patterns and clinical manifestations, with the ultimate objective of discriminating between T-LGL lymphoproliferations developing in different clinical contexts and/or displaying distinct clinical presentation. Altogether, our data demonstrates that the TRB gene repertoire of patients with T-LGL lymphoproliferations is context-dependent, displaying distinct clonal architectures in different settings. Our results also highlight that there are monoclonal T-LGL cells with or without STAT3 mutations that cause symptoms such as neutropenia on one end of a spectrum and reactive oligoclonal T-LGL lymphoproliferations on the other. Longitudinal analysis revealed temporal clonal dynamics and showed that T-LGL cells might arise as an epiphenomenon when co-occurring with other malignancies, possibly reactive toward tumor antigens.</p

High-throughput immunogenetic analysis and molecular characterization of T cells in different prognosis patients with chronic lymphocytic leukemia

Microenvironmental interactions of the malignant clone with bystander T cells are critical throughout the natural history of chronic lymphocytic leukemia (CLL). T cells in CLL serve as a source of trophic signals for the survival of the malignant clone. Alterations in the T cell transcriptome combined with functional exhaustion undermine cytotoxic responses against tumor cells, promoting tumor evasion and escape from immunosurveillance. T cells in CLL also display anti-tumor properties that can be unleashed under stimulation, leading to tumor control. Thus, the recruitment of activated T cells in immune responses against CLL cells represents a promising alternative form of immunotherapy. However, despite early encouraging results of immunotherapy in CLL, only a few patients will benefit and even fewer will experience durable remissions, highlighting the need for a thorough study of T cells in CLL microenvironment.The present study interrogated the T cell receptor (TR) gene repertoire, the composition of cell subpopulations and the functional dynamics of T cells in patients with CLL. In detail, immunogenetic analysis of the TR repertoire was performed in patient subgroups defined by: i) the characteristics of the clonotypic immunoglobulin of the B lymphocyte receptor (BCR IG), namely the SHM status and BcR IG stereotypy, and ii) recurrent genomic aberrations in the genome of CLL cells. Immunogenetic analysis revealed TR repertoire restriction and oligoclonal T cell expansions that persisted and expanded over time. In addition, common clonotypes were identified, shared amongst patients belonging in the same prognostic group or exclusively between CLL patients, supporting that antigen selection processes actively shape the TR repertoire in CLL. These antigens may derive from a limited range of CLL-specific antigens and/or neo-antigens on the leukemic cells. These findings were supported by the in silico prediction of T cells with specificity against neoepitopes postulated to arise from genomic lesions in the TP53 and NOTCH1 genes in the respective subgroups. Τo investigate the impact of different therapies on TR repertoire dynamics, comparative longitudinal analysis of the TR repertoire was performed at the initiation and under different treatment modalities, namely chemoimmunotherapy, or novel agents (inhibitors of BcR signaling or apoptosis). These experiments were combined with analysis of T cell subpopulations by flow cytometry. We found that treatment with novel agents led to a dynamic shift of T cell subpopulations towards activated effector-memory T cells, and we identified TR clonotypes that were retained and further expanded under treatment proportionally to the depth of the clinical response. Finally, confocal microscopy and transcriptome sequencing highlighted functional restoration of T cells after treatment, as they reversed key lesions described as a hallmark of dysfunctional T cells in CLL. In particular, treatment with BcR signaling inhibitors led to the formation of functional immune synapse between T and CLL cells, while the inhibition of the anti-apoptotic protein BCL-2 led to significant changes in the expression profile of CD8+ cells, stemming from downregulation of molecules involved in inhibitory signaling pathways. In conclusion, the present thesis offers strong evidence for the existence of specific anti-leukemic T lymphocytes in CLL targeting neo-antigens on the leukemic clone. These specific T cells display functional restoration under different therapies, further supporting current efforts for T-cell based immunotherapy towards reinvigorating immune responses against CLL cells.Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κακοήθων Β και των Τ λεμφοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον της Χρόνιας Λεμφοκυτταρικής Λευχαιμίας (ΧΛΛ) είναι καθοριστικές για τη παθοφυσιολογία της νόσου. Τα Τ λεμφοκύτταρα στη ΧΛΛ εμφανίζουν διττό ρόλο, καθώς παρέχουν τροφικά σήματα υποστηρίζοντας την επιβίωση των λευχαιμικών κυττάρων, ενώ διατηρούν πληθυσμούς με αντι-λευχαιμικές ειδικότητες που, υπό συνθήκες, ενεργοποιούνται και στρέφονται έναντι των ΧΛΛ κυττάρων. Η στρατολόγηση ενεργοποιημένων Τ κυττάρων σε ειδικές ανοσοαποκρίσεις που στοχεύουν τα ΧΛΛ κύτταρα αποτελεί μια εναλλακτική μορφή ανοσοθεραπείας για την αποτελεσματικότερη διαχείριση του νοσήματος. Ωστόσο, παρά τα πρώτα ενθαρρυντικά αποτελέσματα στη ΧΛΛ, μικρό ποσοστό των ασθενών επωφελείται μακροπρόθεσμα, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για ενδελεχή διερεύνηση της σύστασης και της φυσιολογίας των Τ λεμφοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον της νόσου. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η διαμόρφωση του ρεπερτορίου της β-αλυσίδας του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (ΤκΥ), η σύσταση του πληθυσμού και η δυναμική των Τ λεμφοκυττάρων σε διαφορετικές ομάδες ασθενών με ΧΛΛ. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε ανοσογενετική ανάλυση των γονιδιακών αναδιατάξεων του ΤκΥ σε ασθενείς που ομαδοποιήθηκαν σύμφωνα με: i) τα χαρακτηριστικά της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης του υποδοχέα των Β λεμφοκυττάρων (ΒκΥ), μεταλλακτικό φορτίο και στερεοτυπία, και ii) διακριτές γενωμικές βλάβες στο γονιδίωμα των ΧΛΛ κυττάρων. Τα αποτελέσματα από την αλληλούχηση ανέδειξαν περιορισμούς στο ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων, και ιδιαίτερα στα CD8+ κύτταρα. Επιπλέον, αναγνωρίστηκαν κοινοί κλωνοτύποι μεταξύ ασθενών της ίδιας προγνωστικής ομάδας ή αποκλειστικά μεταξύ ασθενών με ΧΛΛ, ένδειξη ότι το ρεπερτόριο του ΤκΥ προκύπτει από επιλογή συγκεκριμένων κλώνων από ένα περιορισμένο φάσμα ειδικών αντιγόνων ή/και νέο-αντιγόνων. Ως επιπρόσθετη ένδειξη για την ορθότητα αυτής της υπόθεσης, αναγνωρίστηκαν in silico ειδικοί Τ κλωνοτύποι έναντι ανοσογόνων επιτόπων που προέκυψαν από σημειακές μεταλλάξεις στα γονίδια TP53 και NOTCH1 στις αντίστοιχες ομάδες ασθενών. Στη συνέχεια, αντίστοιχη διαχρονική ανάλυση του ρεπερτορίου εφαρμόστηκε και σε ασθενείς με ΧΛΛ πριν από την έναρξη και κατά τη λήψη θεραπείας με ανοσοχημειοθεραπεία ή νέους στοχευτικούς παράγοντες, όπως αναστολείς της σηματοδότησης μέσω του ΒκΥ ή αναστολέα της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης BCL-2, ώστε να διερευνηθεί η επίπτωση των διαφορετικών θεραπειών στη διαμόρφωση του ρεπερτορίου. Συνολικά, τα πειράματα ανέδειξαν δυναμική αλλαγή των μνημονικών Τ λεμφοκυττάρων προς ενεργοποιημένα δραστικά μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε ασθενείς με ύφεση νόσου μετά από θεραπεία με αναστολείς, η οποία συνοδεύτηκε από ταυτοποίηση κλωνοτύπων οι οποίοι διατηρούνταν από τους νέους παράγοντες και εκπτύσσονταν ανάλογα με το βάθος της κλινικής ανταπόκρισης. Τέλος, πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας και αλληλούχησης του μεταγραφώματος ανέδειξαν λειτουργική αποκατάσταση των Τ λεμφοκυττάρων μετά τη θεραπεία, καθώς βρέθηκαν να αναστρέφουν βασικές βλάβες στα Τ κύτταρα. Οι αναστολείς σηματοδότησης οδήγησαν σε βελτίωση της λειτουργικότητας της άνοσης σύναψης μεταξύ Τ και λευχαιμικών κυττάρων, ενώ ο αναστολέας της BCL-2 οδήγησε σε αλλαγή του προφίλ έκφρασης των CD8+ κυττάρων με μείωση της έκφρασης μορίων που συμμετέχουν σε μονοπάτια με ανοσοκατασταλτική δράση. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει ισχυρές ενδείξεις για την ανάπτυξη ειδικών αντι-λευχαιμικών Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με ΧΛΛ ως απόκριση σε νέο-αντιγόνα του λευχαιμικού κλώνου. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να επωφελούνται από διαφορετικές θεραπείες αναστρέφοντας τις λειτουργικές βλάβες που έχουν περιγραφεί στη ΧΛΛ, υποστηρίζοντας τις σύγχρονες προσπάθειες για στρατολόγηση του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι των ΧΛΛ κυττάρων και άρση των μηχανισμών ανοχής για τον περιορισμό του νοσήματος μέσα από ανοσοθεραπεία διαμεσολαβούμενη από ειδικά Τ λεμφοκύτταρα

T Cell Defects and Immunotherapy in Chronic Lymphocytic Leukemia

In the past few years, independent studies have highlighted the relevance of the tumor microenvironment (TME) in cancer, revealing a great variety of TME-related predictive markers, as well as identifying novel therapeutic targets in the TME. Cancer immunotherapy targets different components of the immune system and the TME at large in order to reinforce effector mechanisms or relieve inhibitory and suppressive signaling. Currently, it constitutes a clinically validated treatment for many cancers, including chronic lymphocytic leukemia (CLL), an incurable malignancy of mature B lymphocytes with great dependency on microenvironmental signals. Although immunotherapy represents a promising therapeutic option with encouraging results in CLL, the dysfunctional T cell compartment remains a major obstacle in such approaches. In the scope of this review, we outline the current immunotherapeutic treatment options in CLL in the light of recent immunogenetic and functional evidence of T cell impairment. We also highlight possible approaches for overcoming T cell defects and invigorating potent anti-tumor immune responses that would enhance the efficacy of immunotherapy

High-Throughput immunogenetics for precision medicine in cancer

Cancer is characterized by an extremely complex biological background, which hinders personalized therapeutic interventions. Precision medicine promises to overcome this obstacle through integrating information from different 'subsystems', including the host, the external environment, the tumor itself and the tumor microenvironment. Immunogenetics is an essential tool that allows dissecting both lymphoid cancer ontogeny at both a cell-intrinsic and a cell-extrinsic level, i.e. through characterizing micro-environmental interactions, with a view to precision medicine. This is particularly thanks to the introduction of powerful, high-throughput approaches i.e. next generation sequencing, which allow the comprehensive characterization of immune repertoires. Indeed, NGS immunogenetic analysis (Immune-seq) has emerged as key to both understanding cancer pathogenesis and improving the accuracy of clinical decision making in oncology. Immune-seq has applications in lymphoid malignancies, assisting in the diagnosis e.g. through differentiating from reactive conditions, as well as in disease monitoring through accurate assessment of minimal residual disease. Moreover, Immune-seq facilitates the study of T cell receptor clonal dynamics in critical clinical contexts, including transplantation as well as innovative immunotherapy for solid cancers. The clinical utility of Immune-seq represents the focus of the present contribution, where we highlight what can be achieved but also what must be addressed in order to maximally realize the promise of Immune-seq in precision medicine in cancer