Inhibitor and substrate binding induced stability of HIV-1 protease against sequential dissociation and unfolding revealed by high pressure spectroscopy and kinetics

High-pressure methods have become an interesting tool of investigation of structural stability of proteins. They are used to study protein unfolding, but dissociation of oligomeric proteins can be addressed this way, too. HIV-1 protease, although an interesting object of biophysical experiments, has not been studied at high pressure yet. In this study HIV-1 protease is investigated by high pressure (up to 600 MPa) fluorescence spectroscopy of either the inherent tryptophan residues or external 8-anilino-1-naphtalenesulfonic acid at 25°C. A fast concentration-dependent structural transition is detected that corresponds to the dimer-monomer equilibrium. This transition is followed by a slow concentration independent transition that can be assigned to the monomer unfolding. In the presence of a tight-binding inhibitor none of these transitions are observed, which confirms the stabilizing effect of inhibitor. High-pressure enzyme kinetics (up to 350 MPa) also reveals the stabilizing effect of substrate. Unfolding of the protease can thus proceed only from the monomeric state after dimer dissociation and is unfavourable at atmospheric pressure. Dimer-destabilizing effect of high pressure is caused by negative volume change of dimer dissociation of -32.5 mL/mol. It helps us to determine the atmospheric pressure dimerization constant of 0.92 μM. High-pressure methods thus enable the investigation of structural phenomena that are difficult or impossible to measure at atmospheric pressure. © 2015 Ingr et al.INSERM; Grant Agency of the Czech Republic [P208-12-G016

Nouveaux procédés de conservation des aliments (champs électriques pulsés, traitements combinés haute pression-basse température, homogénéisation haute pression)

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Influence des hautes pressions à température basse ou modérée sur certaines caractéristiques physico-chimiques et biochimiques de systèmes protéiques laitiers (Taille des micelles de caséines, équilibres protéiques et minéraux, aptitude à la coagulation et à l'émulsification)

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Contrôle curriculaire en mathématiques et politiques scolaires à enjeux élevés : analyse de l’argumentation dans un établissement primaire en banlieue de Chicago

Les Etats-Unis sont régulièrement pointés comme un des pays pionniers en matière de réformes scolaires centrées sur les standards et la reddition de compte. L’objet de cet article est d’analyser les processus d’argumentation locaux et des modes de persuasion auxquels les enseignants ont recours lors de l’implantation d’un nouveau curriculum de mathématiques développé pour répondre aux exigences de la reddition de compte à enjeux élevés. L’analyse des processus argumentaires menée dans un établissement d’enseignement primaire de la banlieue de Chicago révèle la manière avec laquelle les enseignants se positionnent vis-à-vis des politiques de reddition de compte à enjeux élevés, et utilisent leur langage et leur rationalité. Elle tend à indiquer que pour faire entendre leurs inquiétudes vis-à-vis du nouveau curriculum et les dégâts qu’il ferait chez les élèves les plus faibles, les enseignants font notamment appel au langage des tests et des standards, référence aux figures d’autorité du district, et insiste sur le faible alignement à l’œuvre entre les multiples messages adressés aux enseignants par l’environnement direct de l’établissement. L’analyse suggère ainsi que la nature de la réponse stratégique des enseignants, souvent décrite dans la littérature comme une forme de protection de leur autonomie individuelle et collective vis-à-vis de la pression bureaucratique croissante, serait également ancrée dans des préoccupations morales et éthiques centrées sur le sort réservé aux élèves les plus faibles dans ce type d’environnement

Caractérisation d'agrégats protéiques et d'émulsions submicroniques préparés par homogénéisation à ultra-haute pression

Des dispersions à 6 ou 10% (p/p) de protéines lactosériques (pH 6,5) ont été traitées par homogénéisation à ultra-haute pression (UHPH ou haute pression dynamique) entre 100 et 300 MPa (Tin = 24C). En parallèle, les dispersions ont subi un traitement thermique en continu de courte durée (STTT) (~ 4s) pour comparaison. Les effets de l'UHPH ou du STTT ont été évalués sur la solubilité des protéines, les caractéristiques physiques des dispersions (viscosite , voluminosité des protéines, paramètres de couleur L*, a*, b*) et la distribution de taille des agrégats protéiques formés. La pression et la température ont été mesurées à l'entrée et à la sortie de la valve haute pression (HP) afin de suivre l'histoire thermomécanique du fluide au cours du procédé. L'effet des forces mécaniques s'ajoute à l'effet de l'échauffement de courte durée qui accompagne le passage du fluide dans la valve HP. Il est possible d'obtenir des agrégats protéiques de taille contrôlée en dessous de 100 nm, à des pressions supérieures à 225 MPa. Des émulsions modèles H/E contenant (p/p) 15, 30 ou 45% d'huile d'arachide et 4,3%, de protéines lactosériques (pH 6,3) ont été élaborées par UHPH (Tin = 24C). La taille des gouttelettes d'huile formées diminue lorsque la pression d'homogénéisation augmente ou lors de passages successifs de l'émulsion dans la valve HP (recyclage). On obtient des gouttelettes d'huile de taille submicronique à des pressions >= 200 MPa, et une distribution monomodale par recyclage à 200 MPa. L'échauffement de courte durée (= 200 MPa (avec ou sans recyclage) présentent une excellente stabilité à l'entreposage à 5C, vis-à-vis du crémage et de la coalescence. Ces émulsions submicroniques resistent à un cycle de congélation/décongélation après UHPH à 200-225 MPa avec ou sans recyclage, selon la composition de l'émulsion. Par contre, le séchage par atomisation d'émulsions préparées par UHPH à 200-250 MPa a induit des phénomènes d'agrégation et de coalescence. Les propriétés tensioactives des protéines lactosériques et d'agents émulsifiants de faible masse moléculaire ont été évaluées pour comparer ultérieurement les caractéristiques d'émulsions élaborées par UHPH avec chacun des agents émulsifiants.Dispersions of whey protein isolate containing 6% or 10% (w/w) protein at pH 6.5 were processed by ultra-high pressure homogenisation (UHPH or dynamic high pressure) between 100 and 300MPa (Tin = 24C). Dispersions were also subjected to short-time thermal treatment (STTT) (4 s) for comparison. The effects of UHPH or STTT were investigated on protein solubility, physical characteristics of dispersions (viscosity, protein voluminosity, L*, a*, b* colour parameters) and size distribution of protein aggregates. Pressure and temperatures were measured at the inlet and outlet of the high pressure (HP) valve to follow the thermo-mechanical history of the processed fluid. Protein aggregation resulted from a combined effect of mechanical forces and short-life heating phenomena by passing through the HP valve. The study indicated the possibility to obtain protein aggregates below an upper limit (100 nm) with a monomodal distribution at homogenisation pressures above 225 MPa. Model O/W emulsions containing (w/w) 15, 30 or 45% peanut oil and 4.3% whey protein at pH 6,3, were processed by UHPH (Tin = 24C). Oil droplet diameters decreased when the homogenisation pressure increased or after emulsion recycling through the HP valve. Submicron droplets were produced at >= 200 MPa and a monomodal distribution was achieved by emulsion recycling at 200 MPa. Short-life heating phenomena (= 200 MPa (with or without emulsion recycling) displayed an excellent stability against creaming and coalescence during storage at 5C. Submicron emulsions resisted to freezing/thawing process after UHPH at 200-225 MPa (with or without emulsion recycling) depending on emulsion composition. On the contrary, spray-drying of emulsions (30% oil, w/w) induced droplet aggregation and coalescence. Interfacial behaviour of whey proteins or low-molecular weight surfactants were evaluated at the O/W interface by tension measurements with a view to compare emulsions characteristics prepared by UHPH using different kind of emulsifying agents.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Impact de traitements à haute pression isostatique ou dynamique sur des systèmes protéiques modèles (recherche d'indicateurs biologiques de traitement)

Des indicateurs biologiques de traitement ont été recherchés pour évaluer l'impact de traitements à haute pression sur des systèmes protéiques modèles tels que (i) l'entérotoxine A de Staphylococcus aureus (SEA) et (ii) un isolat de protéines lactosériques. Les effets de la pression isostatique appliquée à la SEA en solution dans un tampon Tris-HCl (20 mM, pH 7,4) en présence ou non d'agent chaotropique, dissociant ou chélateur (urée 8M, dodécyle sulfate de sodium 30 mM ou acide tétraacétique d'éthylène diamine 1 mM) ont été explorés. Parmi les méthodes étudiées (i.e. toxicité de la SEA sur des cellules Caco-2 ; superantigénicité de la SEA évaluée par la prolifération de lymphocytes T de rat ; immunoréactivité de la SEA), la superantigénicité de la toxine a montré les réponses les plus nettes après traitement de la SEA à 600 MPa pendant 15 min et 20C ou 45C. En parallèle, la fluorescence intrinsèque de la protéine a été étudiée par spectroscopie sous pression entre 10 et 600 MPa, à 20C ou 45C, ou bien en présence d'urée, à 20C. L'ensemble des résultats indique que la pressurisation jusqu'à 600 MPa à 20C entraîne des modifications de structure réversibles sans modification de la réponse superantigénique de la SEA, et donc une baro-résistance de la toxine. Par contre, le traitement à 600 MPa et 45C, ou bien la présence d'urée à 20C (0,1 ou 600 MPa) entraîne des modifications de structure partiellement réversibles accompagnées d'une augmentation de la réponse superantigénique de la toxine. La pression dynamique (aussi appelée homogénéisation à ultra-haute pression, UHPH) appliquée à des dispersions de protéines lactosériques à des niveaux de pression supérieurs à 200 MPa, entraîne la formation d'agrégats protéiques de taille submicronique et contrôlée. Le comportement de ces protéines sur des monocouches de cellules TC7 a été exploré à la fois par l'évaluation de la quantité de protéines transportées à travers les cellules et l'observation des coupes cellulaires par microscopie confocale à fluorescence. Les cinétiques de transport montrent la pénétration progressive de la beta-lactoglobuline (protéine majoritaire) et probablement des agrégats induits par le procédé, à travers la monocouche cellulaire en fonction de la durée d'incubation des cellules.Biological indicators for food processing were studied in view of characterising the effects of high pressure processing on model proteins such as (i) Staphylococcus aureus enterotoxin A (SEA) and (ii) whey protein isolate. The effects of isostatic high pressure applied to SEA solution in Tris-HCl buffer (20 mM, pH 7,4) in the presence or not of chatropic, dissociating or chelating agents (urea 8M, sodium dodecyl sulfate 30 mM or ethylene diamine tetraacetic acid 1 mM) have been investigated. Among the methods tested (i.e. SEA toxicity on Caco-2 cells; SEA superantigenicity as evaluated by the proliferation of rat T lymphocytes; SEA immunoreactivity), SEA superantigenicity displayed the finest changes in the biological responses that SEA could induce after processing at 600 MPa for 15 min and 20C or 45C. In parallel, the intrinsic protein fluorescence was studied by spectrofluorimetry under pressure between 10 and 600 MPa, at 20C or 45C, or in the presence of urea, at 20C. Pressurisation up to 600 MPa at 20C induced structural modifications that were reversible without changes in the SEA superantigenic response, and indicate some baro-resistance of the toxin. In contrast, processing at 600 MPa and 45C, or processing at 20C in the presence of urea (at 0.1 or 600 MPa) induced partially reversible structural changes accompanied by an increase in SEA superantigenicity. Dynamic high pressure (also called ultra-high pressure homogenization, UHPH) at pressure levels above 200 MPa applied to dispersions of whey protein isolate induced protein aggregates of submicron and controlled sizes. The protein behaviour on TC7 cell monolayers was investigated both by assessing the amount of transported proteins through the cells, and using confocal fluorescence spectroscopy. Transport kinetics indicated that beta-lactoglobulin (the major whey protein) and probably the protein aggregates induced by UHPH enter the cell layers and progress inside the cells as a function of exposure time.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

High Stakes Policy and Mandated Curriculum : A Rhetorical Argumentation Analysis to Explore the Social Processes That Shape School Leaders’ and Teachers’ Strategic Responses

Several social processes guide and shape how school actors engage with high stakes state and district policies relative to mandated curriculum and instruction. In this article, we use rhetorical argumentation analysis to explore how stakeholders mobilize resources through argumentation and rhetorical appeals (logical, emotional, and authoritative). However, their mobilization process creates opportunities and constraints for the interpretation and implementation of mandated curriculum. Findings show that school actors use state policy as a resource to make logical and authoritative claims in their attempts to clarify conflicts between new curriculum ideas and their implicit schemas