Production of recombinant human endothelin B receptor in different hosts and its subsequent solubilization and purification

The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.Zellen besitzen die Fähigkeit auf verschiedene Signale aus ihrer Umgebung adäquat zu reagieren und dadurch mit anderen Zellen zu kommunizieren. Die Signale werden durch eine große Anzahl unterschiedlicher Signalstoffe - von Proteinen und kleinen Peptiden über Aminosäuren, Nukleotide, Steroide und Fettsäurederivate bis hinzu gelösten Gasmolekülen wie Stickstoffmonoxid - vermittelt. Einige dieser Moleküle, die klein und hydrophob sind, dringen in die Zielzelle ein, indem sie durch die Lipiddoppelschicht der Zellmembrane diffundieren. Sie aktivieren intrazelluläre Rezeptoren, die dann direkt auf der Ebene der Gentranskription wirken. Die meisten extrazellulären Signalstoffe aber sind hydrophil und folglich nicht in der Lage in die Zelle durch Diffusion einzudringen. Stattdessen binden diese Botenstoffe an der extrazellulären Seite von integralen Membranproteinen, Membranrezeptoren genannt, und lösen eine Signalkaskade im Inneren der Zelle aus. Die größte und pharmakologisch interessanteste Gruppe der Membranrezeptoren ist die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (G-protein coupled receptors (GPCR)). GPCR-kodierende Gene machen zwischen ein und fünf Prozent des Wirbeltiergenoms aus (ca. 1% des menschlichen Genoms). Da G-Protein gekoppelte Rezeptoren der Angriffspunkt vieler Medikamente sind, sind sie von großer Bedeutung für die pharmazeutische Industrie. GPCRs besitzen sieben die Membran durchspannende Helices (sieben transmembrane Helices) und sind für die Übertragung des Signals aus der extrazellulären Umgebung in die Zelle verantwortlich. Die Signalkaskade hat folgenden Ablauf: der Ligand, der auf der extrazellulären Seite bindet, löst eine Konformationänderung des Rezeptors aus. Wenn der Ligand ein Agonist ist, wird diese Konformationsänderung auf die intrazelluläre Seite des Rezeptors übertragen, wodurch hetrotrimere G-Protein an ihn binden. Die Bindung an dem Rezeptor verursacht die Dissoziation des G-Proteinkomplexes in alpha und betagamma Untereinheiten, welche daraufhin verschiedenen Effektorsysteme aktivieren. Um den Mechanismus der Signalübertragung zu verstehen und neue Angriffspunkte für diese medizinisch wichtige Proteinfamilie entwickeln zu können ("structure-based drug design"), ist die dreidimensionale (3D) Strukturaufklärung notwendige Voraussetzung. Bisher ist nur eine hochauflösende Struktur des Rhodopsin aus Rinder-Retina mit einer Auflösung von 2,8 Å gelöst worden. Die Struktur anderen GPCRs wurde daraufhin am Computer simuliert. Der Endothelin-B-Rezeptor (ETB), dessen Überproduktion, Solubilisierung und Reinigung das Thema dieser Arbeit ist, gehört zur Gruppe A ("Rhodopsin ähnlich") der G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Der ETB Rezeptor wird vom Peptidligand Endothelin aktiviert, wodurch die Signalkaskade gestartet wird, die letztendlich zur Erweiterung der Blutgefäße führt. Der ETB Rezeptor ist außergewöhnlich, weil er seinen Ligand fast irreversibel bindet. Deswegen und hinsichtlich seines pharmakologischen Wertes ist seine 3D-Struktur äußerst interessant. Die Voraussetzung für die Aufklärung der 3D-Struktur von G-Protein gekoppelten Rezeptoren ist die Verfügbarkeit großer Mengen homogenen Proteins. Die benötigten Proteinmengen könnten nicht aus natürlichen Quellen gewonnen werden, da das Protein nur in geringen Konzentrationen im Gewebe exprimiert wird. Zusätzliche Probleme liefert die Heterogenität der Rezeptoren, da mit Hilfe von molekularbiologischen und pharmakologischen Techniken verschiedene Subtypen im Gewebe identifiziert werden konnten. Sie sind während der Reinigung sehr schwer oder überhaupt nicht voneinander zu trennen. Um ausreichende Mengen an dem gewünschten Rezeptor homogen zu produzieren, greift man auf geeignete Expressionssysteme für Heterologen Rezeptorproduktion zurück. Jedoch ist die Wahl eines geeigneten Expressionssystems nicht einfach. Es ist zu bedenken, dass es sich bei G-Protein gekoppelten Rezeptoren um Membran-proteine handelt, deren hydrophobe Domänen in die Membran inseriert und richtig gefaltet werden müssen. Zusätzlich können sie eine Vielzahl von komplizierten post-translationalen Modifikationen tragen. Die Eignung verschiedener Expressionssysteme - Hefe, Insekten- und Säugerzellen - zur funktioneller Überproduktion von ETB Rezeptor wurde in dieser Arbeit getestet und anschließend die entsprechenden Solubilisierungs- und Reinigungsmethoden, die eine homogene Rezeptorpräparation zum Ziele hatte. Hefen sind einzellige Eukaryonten, die den Vorteil eines eukaryontischen Wirtes, der die notwendigen post-translationalen Modifikationen an humanen Proteinen durchführen, mit sich bringt. Zusätzlich stellen sie ein kostengünstiges, leicht skalierbares Expressionssystem für die Produktion großer Proteinmengen dar. In dieser Arbeit wurde Pichia pastoris als Wirt zur Produktion von ETB Rezeptor verwendet. Sie ist eine methylotrophe Hefe, die fähig ist als einzige Kohlenstoffquelle Methanol zu nutzen. Die Hauptvorteile von P. pastoris sind wie folgt: 1) ist es möglich mit dem starken Genpromotor der Alkoholoxidase 1 (AOX1) ein hohes Niveau der heterologen Proteinexpression zu erzielen (30% des gesamten Zellproteins) 2) lässt sie sich gut zu hohen Dichten (bis 500g Feuchtgewicht/L) im Fermenter anziehen 3) wird das geklonte Konstrukt mit dem Rezeptorgen beständig in das Hefegenom integriert. Zusätzlich ist die Selektion von Klonen mit mehrfachen Geninsertionen möglich 4) ist P. pastoris zum Durchführen der post-translationalen Modifikationen fähig (Glykosylierung, Phosphorylierung, Palmitoylierung und Disulfidbindungs-anordnungen). 5) gibt es keine Hyperglykosylierung des produzierten Proteins, wie in dem Fall von S. cerevisiae. Insektenzellen und Säugerzellen bieten die authentische Umgebung für die Expression von G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Diese Expressionssysteme haben den eindeutigen Vorteil, dass die Faltung und alle post-translationalen Modifikationen am produzierten Rezeptor leistungsfähig durchgeführt werden. Eine effektive Methode zur transienten Expression von fremden Proteinen in Insekten- und Säugtierzellen bietet sich durch rekombinanten Viren. Eine hohe Infektionsfähigkeit in einer Vielfalt von Zellen, die infiziert werden können, ist der Hauptvorteil dieses Systems. Im Fall von Insektenzellen werden rekombinante Baculoviren (insekten-pathogene doppelsträngige-DNS Viren) genutzt. Rekombinante Alfaviren (kleine umhüllten Viren mit einem einzelsträngigen RNS-Genom) wie z.B. Semliki-Forest-Virus, werden zur transienten Expression des fremden Proteins in Säugerzellen verwendet. Liljestrom & Garoff entwickelten die SFV-Expressionvektoren mit dem Ziel der Produktion großer Mengen von rekombinantem Protein in Säugerzellen (Liljestrom&Garoff, 1991). Das SFV-Expressionssystem hat sich als besonders geeignet für die GPCR-Expression erwiesen (Lundstrom, 2000). Der Endothelin B Rezeptor wurde während dieser Arbeit in unterschiedlichen Wirten produziert: in der Hefe P. pastoris, in Sf9-Insektenzellen und in CHO-Säugerzellen. Die höchste Ausbeute an aktivem Rezeptor wurde in Hefe erhalten; der Klon FlagHisETBBio mit einer Expressionsrate von 60 pmol/mg, erbrachte 1,2 mg Rezeptor/L Schüttelkultur. Durch Fermentation des gleichen P. pastoris Klons im 10L-Fermenter, war es möglich, 3kg Hefezellen zu erhalten, die 20-39 mg des aktiven Rezeptors enthielten. Die Menge an aktivem ETB-Rezeptor, der in Insektenzellen mit einer maximalen Expression von 30 pmol/mg produziert wurde, war 0,7 mg Rezeptor/L Zellkultur. Die damit erreichte Menge stimmt mit den vorher berichteten Werten überein (Doi et al., 1997). Verglichen mit der ETB Rezeptor-produktion in Hefe, ist die Ausbeute an aktivem Rezeptor in Insektzellen niedriger und die Systembehandlung ist zeitaufwändiger, wird aber durch eine homogene Rezeptorpräparation nach der Reinigung belohnt. Die Expression des aktiven ETB-Rezeptors von 7 pmol/mg in den CHO-Zellen ist niedriger als erwartet, wenn man in Betracht zieht, dass das Vektorkonstrukt pSFV3CAPETBHis, der zur Rezeptorproduktion benutzt wurde, ein Gen für das Capsidprotein enthält. Dieses Gen hat ein "translation-enhancer" Signal auf seinem 5'-Ende, das im Fall anderer GPCRs zu in einer mehrfach höheren Expression im Vergleich zum Konstrukt ohne das Capsidprotein führte (Lundstrom et al., 2001). CHO-Zellen sind zweifellos der finanziell anspruchsvollste Wirt für die Rezeptorproduktion und kann mit einer in dieser Arbeit erzielter Expression von ETB-Rezeptor von 7 pmol/mg nicht für eine Rezeptorproduktion in großen Maßstab empfohlen werden. Es sollte erwähnt werden, dass der am häufigsten genutzte Wirt zur Proteinproduktion, E. coli, als Wirt für die ETB-Produktion in dieser Arbeit nicht ausgewertet wurde. Frühere Versuche in E.coli erbrachten 41 aktiv bindende ETB Rezeptor/Zell (Haendler et al., 1993), die erreichten Expressionsraten sind aber zu niedrig, um E. coli als konkurrenzfähiges System für die heterologe Produktion des ETB-Rezeptors im großen Maßstab betrachten zu können. Für die Überproduktion des ETB-Rezeptors in Hefe und Insektenzellen wurde der Klon FlagHisETBBio ausgesucht, der drei verschiedene Affinitätsanhängseln hat. Aufgrund dieser Affinitätsanhängsel war es möglich, einige Reinigungsstrategien zu testen und effizientestere zu bestimmen. Außerdem haben diese "Tags" den immunologischen Nachweis von produzierten Rezeptorfusionen ermöglicht. Der "Bio-Tag" wird in P. pastoris und in den Insektzellen biotinyliert, was durch Immunoblotanalyse mit Streptavidin bestätigt wurde. Die Präsenz von "Bio-Tag" wurde in dieser Arbeit zur Reinigung der Rezeptorfusion mit Avidin verwendet. Auch wurde in dieser Arbeit der Rezeptor immer als Komplex mit dem Liganden ET-1 gereinigt, der an den Rezeptor fast irreversibel bindet und dadurch den nativen Rezeptor stabilisiert. Jedoch war der Nachteil dieser Reinigungsstrategie, dass die Bestimmung der Rezeptorausbeute mittels Radioligandenbindung während der unterschiedlichen Reinigungsschritte nicht möglich war. Der in Hefe überproduzierte Rezeptor wurde mit dem Detergenz n-Dodecyl-beta-D-Maltozid aus Hefemembranen solubilisiert, da in früheren Solubilisierungsstudien an aus Hefe gewonnenem ETB-Rezeptoren dieses Detergenz die besten Ergebnisse erzielte (Schiller et al., 2001). Als effizienteste Rezeptorreinigung hat sich die zweistufige Affinitätschromatographie mittels Ni-NTA und Avidin-Matrix gezeigt. Der Rezeptor wurde zuerst durch die Ni-NTA-Matrix mittels seines His-Tags gereinigt. Nach diesem Reinigungsschritt waren immer noch Verunreinigungen auf dem Silber-gefärbten Gel des Eluats zu sehen. Die Avidin-Affinitätsmatrix wurde als zweiter Schritt in der Rezeptorreinigung eingesetzt. Dieser Reinigungsschritt erbrachte mehr als 95% reinen Rezeptor (durch Silberfärbung abgeschätzt) und meistens enthielt das Eluat nur eine Verunreinigungsproteinbande. Die Versuche, den Rezeptor über andere Affinitätsmatrizen, wie M1-anti-Flag Antikörper und Streptavidin, zu reinigen, wurden wegen starker Aggregationsbildung aufgegeben. Die Aggregationstendenz des in Hefe produzierten ETB-Rezeptors stellte ein ernstes Hindernis für die Kristallisationsanforderungen dar. Zahlreiche Versuche wurden in dieser Arbeit unternommen, um eine Lösung für dieses Problem zu finden. Es gibt eine Vielzahl von möglichen Ursachen für die Rezeptoraggregation. In dieser Arbeit wurde eine Anzahl von Additiven zur Vermeidung dieses Verhaltens ausprobiert. Darunter waren kurzkettige Lipide (1,2-Dicaproyl-n-Glycero-3-Phosphocholine, 0,2%), physikalische Chaperone wie Ectoine und Hydroxyectoine (je 1%), Cholesterin-hemisuccinate (0,5%) und DMSO (2%). Keins dieser Additive konnte die monomere Form des Rezeptors stabilisieren und Bildung von Rezeptoraggregaten völlig verhindern. Nach der Rezeptorproduktion in Baculovirus infizierten Insektenzellen wurde ein geeignetes Detergenz für die Solubilisierung ausgesucht. Die Rezeptoraffinitäts-messungen mittels radioaktivem [I125] ET-1-Liganden zeigten, dass n-Dodecyl-beta-D-Maltosid (LM), Lauryl-Saccharose (LS) und Digitonin/Cholat (D/C) die größte Menge aktiven Rezeptor brachten. LM wurde für die weitere Arbeit verwendet. Das Konstrukt FlagHisETBBio aus Insektenzellenmembranen wurde mit LM solubilisiert und in zwei Schritten mittels über Ni-NTA- und Avidin-Chromatographie analog zur Hefe-Prozedur gereinigt. In diesem Fall gelang es eine homogene Form des ETB-Rezeptors zu erhalten, wie die Gelfiltrationsanalyse (Superose 6) zeigte. Angeregt durch kürzlich erschienene Daten bezüglich der Homo- und Hetero-oligomerisierung von GPCRs, wurde der Oligomerisationszustand des ETB-Rezeptors durch "native blue" Elektrophorese untersucht. Eine deutliche Bande mit einem Molekulargewicht des Rezeptordimers konnte nachgewiesen werden. Jedoch sind weitere Experimente erforderlich, um zu einen definitiven Beweis für die Rezeptordimerisierung zu gelangen, da die native Elektrophorese Artefakten in manchen Fällen produzieren kann. Die Hefe P. pastoris konnte als zuverlässiges Produktionssystem für den ETB-Rezeptor mit hohen Ausbeuten an aktivem Protein etabliert werden. Milligrammmengen des gereinigten Rezeptors wurden nach der Affinitätsreinigung erhalten, die die Ni-NTA und Avidin-Matrizen kombinierte. Jedoch konnte das Problem der Rezeptoraggregation in diesem Fall nur teilweise gelöst werden. Weitere Bemühungen sind erforderlich. Die Rezeptorproduktion in den Insektzellen ergab weniger Rezeptor im Vergleich zu P. pastoris, ist jedoch vielversprechender, da in diesem Fall der Rezeptor in der homogenen monomeren Form nach der Reinigung erhalten wurde. Die in Hefe und Insektenzellen produzierten Mengen des Rezeptors und seine Aktivität stellen eine gute Grundlage für den Beginn der 3D- und zur Fortsetzung von 2D-Kristallisationsversuchen dar. Obwohl die Expression des ETB-Rezeptors in Säugerzellen mittels Semliki-Forest-Virus optimiert werden muss, bietet diese Art transienter Expression interessante Möglichkeiten für Funktionsstudien, da sich der Rezeptor hier in seiner natürlichen Umgebung befindet. Es wäre interessant, die Frage der Rezeptor-Oligomerisierung mittels FRET (Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung) oder BRET (Bio-lumineszenzresonanz-Energieübertragung) zu untersuchen. Diese Methoden waren sehr informativ im Fall von anderen G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Bouvier, 2002) und konnten interessante Einblicke über die endogene, aktive Form und die in vivo Dimerisierung des ETB-Rezeptors geben. Bisher gibt es kein Testsystem für in vivo G-Proteinkopplung von G-Protein gekoppelte Rezeptoren, die in P. pastoris produziert wurden. Diese Hefe hat sehr niedrige Menge an endogen exprimierten G-Proteinen und eine sehr begrenzte Zahl unterschiedlicher G-Proteine. Eine Möglichkeit wäre einen P. pastoris Stamm genetisch so zu verändern, dass er entweder das Protein G16 oder Gq und Gi, die Hauptpartner für die Kopplung mit dem ETB, zusammen mit den Untereinheiten betagamma produziert. Bei einem solchen Stamm wäre es möglich, die Rezeptorsaktivität im Hefesphäroplasten nach Ligandenzugabe direkt durch die Ca2+-Konzentrationsänderungen zu messen

MARKETING INFLUENCE ON STUDENTS LOYALTY AND FUTURE INTENTIONS IN HIGHER EDUCATION

Applying the marketing concept in higher education can significantly improve the performance of these institutions. The role of marketing is particularly important in ensuring the loyalty of students and timely influence on their future intentions, especially nowadays when the decrease in the number of students is a big problem in our country, but also in neighboring countries. From the marketing aspect, this paper provides the results of research on the relationship between student loyalty and their future intentions in higher education. The research was conducted on students of two state universities in the Republic of Srpska. Research results show that there is a strong relationship between student loyalty and future intentions of students in higher education. The obtained results are significant for universities that want to keep students at the institution, but also to secure partners even after the completion of their studies

Contribution to the knowledge of serpentine flora in western Kosovo, with comparisons of the western, central and northern serpentine massifs

This article presents the results of a floristic survey conducted between 2011 and 2021 on Mt. Kaznik, western Kosovo. In all, 361 plant taxa belonging to 75 families and 147 genera of vascular flora were recorded. These areas are dominated by serpentine soils, which are known for the increased occurrence of endemic plant taxa. Detailed analysis of chorological and biological data in conjunction with general vegetation data has highlighted the distinctive nature of Mt. Kaznik, making it a floristically important area. Of the taxa identified, 15 were classified as threatened plant taxa at the national level, while a total of 17 taxa are endemic plants. For each plant taxon, data on floristic element, habitat characteristics, life form, and general vegetation data are provided. A syntaxonomic analysis of the recorded taxa showed that they belong to nine vegetation classes, with the pubescent oak and mixed deciduous forest class Quercetea pubescentis being dominant. In addition, a floristic comparison was made between the serpentines of Kaznik and those in central and northern Kosovo. Considering the floristic importance and the high degree of diversity exhibited by the serpentines, the data presented are of particular importance to a better understanding of the floristic composition of Kosovo

Attractiveness of foreign investments in Albania: a focused analysis of factors, constrains and policy assessment

Foreign direct investments are very important for the implementation of strategic reforms, transfer of advanced technologies and managerial methods, thereby stimulating economic growth in developing countries and in particular, transition economies such as Albania is. During the last years, Albania experienced an increase in foreign investors’ interest in a wide range of sectors, with energy generation, telecommunication, cement production, mining, oil and industrial parks heading the list. However, the major obstacle factors for FDI inflows seem to remain the same: pervasive corruption, weak law enforcement, poor rule of law, lack of developed infrastructure, lack of a reliable energy supply and insufficiently defined property rights. Determining the factors that attract FDI, and furthermore identify the main characteristics of the host country’s economy, are essential to understand the reason of FDI inflows to a country or region. In the empirical perspective, various studies give different results. More specifically, this paper has focused on determining the factors for and against FDI in Albania

Management of the taxation on tourism operators, an important component of revenues and investments in the tourism sector

We are trying to bring here the importance that tourism taxation has. Based on the fact that tourism industry is becoming one of the most important branches of the economy, it is essential to find the best solution, the best taxes rates that would encourage tourism development, and the most important part is that this funds should be used to invest, to refund tourism industry. In this way we will have an increase of the income from the tourism. Of course, a strong taxation system will have negative impact on tourism industry. High rates of taxes would have negative impact on competitiveness, and would be a great disaster towards competitiveness and incomes. It is extremely important, to do the best towards the tax system, in this way the tourism could be encouraged. To better understand the system taxation in tourism we did the SWOT analyses. Based on these analysis we are going to bring here some conclusions and recommendations

Plurilingüismo en el teatro tardomedieval y renacentista: juego de voces

Readings of Gil Vicente’s farce Quem tem farelos? and Joan Fernández de Heredia’s La vesita are ordered by voices, subjects, techniques, resources and characters. This confirms that, throughout the Iberian Peninsula and during the late medieval period, there was a circulation of practices and common heritage, precedents of inmediately subsequent dramatics.Se ordena la lectura de las farsas de Gil Vicente, Quem tem farelos?, y de Joan Fernández de Heredia, La vesita, por voces, temas, técnicas, recursos y personajes presentes en ambas obras. Se confirma que a lo largo y ancho de la Península Ibérica, en el periodo tardomedieval, hubo una circulación de prácticas y acervos comunes, precedentes de periodos de la teatralidad inmediatamente posterior.

IMPORTANCE OF EXTERNAL AND INTERNAL ENVIRONMENT IN CREATION OF COMPETITIVE ADVANTAGE TO SMEs. (CASE OF SMEs, IN THE NORTHERN REGION OF ALBANIA)

External and internal factors have crucial impact to SMEs environment. Nowadays business environment is more global and competitive than it has been in the past. A broad range of business factors are connected to SME’ competitive advantage. The aim of this research is to show the importance of external and internal factors in creation of the SME’s competitive advantage. The resource – based view of the SMEs, such as capabilities, competencies etc., and the threat of new entrants, rivalry, threat of substitutes, supplier power and buying power; the combine of these factors are in the center of this study. Firms need to better understand the competitive environment and develop strategies that create sustained competitive advantage. Then we present our study methodology used on this study which consists in a combination of qualitative and quantitative method. To realize the aim of this study are determines some objectives and research question pertaining the impact of the external and internal factors, such as Porter’s five forces or, tangible and intagible assets in the creation of competitive advantage etc. Based on the research questions are made hypothesis. The empirical analyze is done to understand the potential sources of competitive advantage for SMEs. Study consists on a final sample of 460 participant from different small and medium enterprises in Northern Albanian Region. It is used regression analysis. The result revealed that both, external and internal factors have positive affect in competitive advantages of SMEs. Based on the result of this analyze are done conclusions. Findings support the idea, within limitations, that external environment have greater impact than internal environment on SME’s success. Results strongly suggest some important academic and practitioner implications and some suitable recommendations

Static eccentricity fault detection method for electrical rotating machines based on the magnetic field analysis in the air gap by measuring coils

Electrical rotating machines have a great economic significance as they enable conversion of energy between mechanical and electrical state. Reliability and operation safety of these machines can be greatly improved by implementation of continuous condition monitoring and supervisory systems. Especially important feature of such systems is the ability of early fault detection. For this reason, several methods for detection and diagnosis of the machine faults have been developed and designed. As fault detection methods can largely differ in the types of detectable faults, machine adoptability and price of the system, a novel method was developed that can be used for cost-effective detection of various faults of electrical machine. Machine fault detection technique presented in this paper is based on the measurement of magnetic field in the air gap. Numerous studies have proven that crucial information about the machine condition can be determined based on measurement and analysis of the magnetic field in the air gap. It has also been confirmed that analysis of the air gap magnetic field can be used to detect, diagnose and recognize various electrical faults in their very early stage. Proposed method of positioning and installation of the measuring coils on ferromagnetic core parts within the air gap region of the machine enables differentiation of various faults. Furthermore, different faults can be detected if measuring coils are placed on the stator teeth then when placed on the rotor side. The paper presents method on how to analyse and process the measured voltages acquired from measuring coils placed within the machine, especially in the case of rotor static eccentricity detection. The methodology is explained by means of finite element method (FEM) calculations and verified by measurements that were performed on the induction machine. FEM calculation model was used to predict measurement coil output of the induction motor for healthy and various faulty states (at different amounts of static eccentricity). These results were then confirmed by measurements performed in the laboratory on the induction traction motor that was specially modified to enable measurements of faulty operation states of the machine. Measurements comprised of several machine fault conditions broken one rotor bar, broken multiple rotor bars, broken rotor end ring and various levels of rotor static eccentricity. Other methods used for faults detection are primarily based on the monitoring of quantities such as current and vibration and their harmonic analysis. This new system is based on the tracing the changes of induced voltage of the measuring coils installed on the stator teeth. Faults can be detected and differentiated based on RMS value of these voltages and the number of voltage spikes of voltage waveform i.e. without the need of harmonic analyses. If these coils are installed on the rotor it is possible to detect the stator winding faults in a similar manner