Transcriptomic response to prolonged ethanol production in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803

BACKGROUND: The production of biofuels in photosynthetic microalgae and cyanobacteria is a promising alternative to the generation of fuels from fossil resources. To be economically competitive, producer strains need to be established that synthesize the targeted product at high yield and over a long time. Engineering cyanobacteria into forced fuel producers should considerably interfere with overall cell homeostasis, which in turn might counteract productivity and sustainability of the process. Therefore, in-depth characterization of the cellular response upon long-term production is of high interest for the targeted improvement of a desired strain. RESULTS: The transcriptome-wide response to continuous ethanol production was examined in Synechocystis sp. PCC6803 using high resolution microarrays. In two independent experiments, ethanol production rates of 0.0338% (v/v) ethanol d(-1) and 0.0303% (v/v) ethanol d(-1) were obtained over 18 consecutive days, measuring two sets of biological triplicates in fully automated photobioreactors. Ethanol production caused a significant (~40%) delay in biomass accumulation, the development of a bleaching phenotype and a down-regulation of light harvesting capacity. However, microarray analyses performed at day 4, 7, 11 and 18 of the experiment revealed only three mRNAs with a strongly modified accumulation level throughout the course of the experiment. In addition to the overexpressed adhA (slr1192) gene, this was an approximately 4 fold reduction in cpcB (sll1577) and 3 to 6 fold increase in rps8 (sll1809) mRNA levels. Much weaker modifications of expression level or modifications restricted to day 18 of the experiment were observed for genes involved in carbon assimilation (Ribulose bisphosphate carboxylase and Glutamate decarboxylase). Molecular analysis of the reduced cpcB levels revealed a post-transcriptional processing of the cpcBA operon mRNA leaving a truncated mRNA cpcA* likely not competent for translation. Moreover, western blots and zinc-enhanced bilin fluorescence blots confirmed a severe reduction in the amounts of both phycocyanin subunits, explaining the cause of the bleaching phenotype. CONCLUSIONS: Changes in gene expression upon induction of long-term ethanol production in Synechocystis sp. PCC6803 are highly specific. In particular, we did not observe a comprehensive stress response as might have been expected

Novel approaches toward the development of an oral post-exposure DNA vaccine for latent tuberculosis using Salmonella typhimurium ΔaroA vector

Tuberculosis remains one of the major causes of global public health problems. There is no effective vaccine for the disease until now. Many reports show that DNA vaccines are promising to induce protection against Mycobacterium tuberculosis (M. tb); however, the efficiency of DNA vaccine is limited due to inadequate delivery systems. Among others, live attenuated bacterial vectors such as Salmonella enterica typhimurium (S. typhimurium) have significant promise as efficient mucosal delivery vehicles for DNA vaccines. In this study, we constructed recombinant attenuated S. typhimurium DNA vaccines carrying genes encoding resuscitation promoting factor (Rpf)-like proteins of M. tb on eukaryotic expression plasmid agianst latent tuberculosis and evaluated the plasmid stability and growth curve assays of the recombinant Salmonella vaccine constructs in vitro. Four Rpf gene fragments (RpfB, RpfC, RpfD, RpfE) associated with latency were amplified from genomic DNA of the H37Rv strain of M. tb, cloned into eukaryotic expression plasmid (pVR1020) and verified by sequencing. In later studies, we will demonstrate the potential use of the Salmonella-mediated DNA constructs as candidate post-exposure vaccines against tuberculosis through testing their immunogenicity and effectiveness for oral delivery in eukaryotic systems.Key words: Latent tuberculosis, resuscitation promoting factor (Rpf), DNA vaccine, recombinant Salmonella typhimurium

Analisa Pondasi Pile Raft Pada Tanah Lunak Dengan Plaxis 2d

Permasalahan penurunan menjadi salah satu masalah yang sering dihadapi para perencana pondasi bangunan dikarenakan oleh kondisi tanah yang lunak. Untuk mengatasi permasalahan yang ada, banyak perencana menggunakan pondasi raft atau pondasi rakit, karena dianggap mampu memberikan faktor keamanan yang memadai dalam menghadapi kegagalan daya dukung ultimate. Namun diperkirakan pondasi raft ini akan mengalami penurunan yang besar. Permasalahan tersebut mungkin dapat berkurang jika adanya penambahan pile pada pondasi raft sehingga menjadi pondasi pile raft. Dengan penambahan pile pada pondasi raft diharapkan perencanaannya mempertimbangkan segi ekonomis. Dengan menggunakan beban merata 6 t/m2, dilakukan penelitian pada pondasi pile raft dengan memvariasikan tebal raft yakni 80 cm, 100 cm, 120 cm dan 140 cm. Untuk panjang pile divariasikan dari panjang 5 m, 7 m, 9 m, 13 m dan 15 m. Analisis penurunan dilakukan dengan menggunakan software Plaxis 2D dan Metode Poulos. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa Penambahan jumlah pile pada pondasi raft menghasilkan profil penurunan yang berkurang namun pada suatu keadaan tertentu penambahan pile tidak memberikan kontribusi yang lebih signifikan. Begitupun dengan perhitungan Poulos, pada konfigurasi pile tertentu tidak memberi kontribusi lagi. Sehingga desain yang ekonomis pada penelitian ini adalah dengan menggunakan tebal raft 80 cm dengan panjang pile 13 m dan konfigurasi pile 7x7

Cold adaptation of Listeria monocytogenes

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der Kälteschock-Antwort von L. monocytogenes. Mit Hilfe von Microarray-Analyse wurden die Transkriptionsprofile bei 37°C sowie jeweils nach einer, zwei und vier Stunden nach der Temperatursenkung auf 15°C ermittelt und verglichen. Die Analyse ergab, dass ca. 15 % des Genoms nach dem Kälteschock verändert exprimiert wurde. Die deutlichsten Unterschiede in den Expressionsprofilen fanden sich nach einer Stunde nach dem Kälteschock. Die beobachtete Anzahl an unterschiedlich exprimierten Regulatoren deutet auf die Anpassung mehrerer Stoffwechselwege hin. Kohlenstoffmetabolismus und Energieproduktion in Form von ATP, sowie Sekundärmetabolismus und Transportsysteme für Zucker und Aminosäuren verlangsamten sich. Die Expression von Virulenz- und Hitzeschock-relevanten Genen wurde runterreguliert. Damit werden Ressourcen für die Biosynthese der kälteinduzierten Proteine frei. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der am stärksten veränderte Prozess nach dem Kälteschock die Proteinbiosynthese ist. Es wurde kein spezieller Sigma-Faktor gefunden, der an der Expression der kälteinduzierten Gene beteiligt ist. Daher scheint die Anpassung der Proteinbiosynthese eher durch die Veränderungen am Ribosom zu erfolgen. Zum Beispiel ist bipA (lmo1067) ein möglicher Translationsfaktor, der speziell bei der niedrigen Temperatur verstärkt exprimiert wird und eine Rolle bei der Translation spielt. Die Bedeutung der RNA-Helikasen nach dem Kälteschock konnte noch einmal bestätigt werden. Die Gene der RNA-Helikasen wurden bei L. monocytogenes EGD-e deletiert und zeigten alle bis auf Delta lmo1246, einen kältesensitiven Phänotyp. Um die Kälteschockantwort bei L. monocytogenes genauer zu charakterisieren, wäre es interessant, die Target-Gene, auf deren Transkripten die RNA-Helikasen binden und die Translation nach dem Kälteschock begünstigen, zu identifizieren. Ihre Identifizierung könnte das Verständnis der nach Kälteschock veränderten Zellphysiologie vertiefen. Um die Regulation der Expression von RNA-Helikasen bei den niedrigen Temperaturen zu untersuchen, gilt es nun, diejenigen Faktoren zu finden, die an Promotor-Bereich der Helikase-Gene binden und so deren Expression regulieren. Auch die Interaktion zwischen den RNA-Helikasen und dem cspLA Gen ist noch nicht abschließend untersucht. Die Microarray-Analyse der Kälteschockantwort in der Delta cspLA Mutante im Vergleich zu dem Wildtyp könnte die Gene aufschließen, deren Transkription bei der Kälte durch cspLA beeinflusst wird. Die Expression des flaA Gens bedarf einer näheren Untersuchung. Bekannt ist, dass die Expression des flaA Gens in der Delta cspLA Mutante auf Transkriptionsebene verhindert wird (Busch, 1998). Ob ein Fehlen der entsprechenden Helikase die Synthese des FlaA-Proteins auf Transkriptions- oder Translationsebene hemmt, bedarf ebenfalls weiterer Experimente. Mit Hilfe einer flaA Sonde wäre ein Transkript des flaA Gens in den Delta-Helikasen-Mutanten nachzuweisen, bzw. auszuschließen. Die Frage nach einem globalen Sensor für die Kälte in L. monocytogenes blieb in vorliegender Arbeit offen. Zum Überprüfen dieser Hypothese bieten sich die Deletion des als potenzieller Sensor identifizierten Gens lmo0799 und eine anschließende Charakterisierung unter verschiedenen Temperaturen und Lichtbedingungen an.Low temperature stress is wide spread situation either for soil borne or pathogenic bacteria. Cold stress tolerance of L. monocytogenes markedly contributes to its dissemination through refrigerated food products. Ability to grow effectively at refrigerator temperatures leads to multiplication of bacteria to dangerous concentration even in slightly contaminated protein reach products and spoilage of the food. In this work are first presented the results of DNA micro-array based study about response of L. monocytogenes genome to the drop of temperature. Produced mutants contribute to under-standing of role of single genes in cold adaptation of L. monocytogenes. For analysis of transcriptional response of L. monocytogenes EGD-e to cold shock the sam-ples were taken after 1, 2, and 4 h after rapid decrease of grow temperature from 37°C to 15°C. Transcriptional profiles using whole-genome DNA micro-array after CS were com-pared to the one at 37°C. This approach revealed 214 induced and 220 genes with decreased expression after cold shock, which means 15 % of total genome. Maximal number of genes was observed after 1 h after cold shock, giving evidence for strong alteration of cell metabo-lism directly after cold shock. The large number of differently expressed regulator proteins indicates on the adaptation of many different metabolic pathways. Carbohydrate metabolism and energy production in form of ATP were repressed, as well as secondary metabolism and transport of sugars and amino acids. The expression of virulence and heat shock genes were also repressed. This could be the way to save the resources for expression of cold shock specific genes. The strongest effected process is protein biosynthesis. No special cold sigma factor for ex-pression of cold shock genes could be identified. So the adaptation of biosynthesis seems to go through the alteration of ribosomes. For example, the cold induced gene with GTPase ac-tivity bipA is a possible translation factor for adaptation of translation to the low temperature. The role of RNA-helicases on cold adaptation was affirmed. Deletion mutants were produced for all RNA helicases genes and showed beside of lmo1246 the cold sensitive phenotype. For the better understanding of cold shock process it would be interesting to find the target genes, on which bind the RNA helicases and facilitate its expression at low temperature. The regulation of RNA helicases expression is itself a possible target for the further experiments. The question about the general cold sensor in L. monocytogenes remained open. For the vali-dation of this hypothesis deletion of the gene for potential sensor lmo0799 and characterisa-tion of mutant is possible