Fertilization and cleavage after protein kinase c activation during bovine oocyte maturation

A formação de pró-núcleos, clivagem e perfil protéico foram avaliados após a ativação da proteína quinase C (PQC) durante a maturação de complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. Visando a determinar estes efeitos da PQ-C, 1936 CCOs foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, sendo maturados na presença de PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, ativador da PQ-C), de 4α-PDD (100nM de 4α- phorbol 12,13-didecanoetate, forbol éster que não ativa a PQ-C; controle forbol éster), de SVE (10% de soro de vaca em estro, controle positivo) e de um controle negativo constituído pelo meio de maturação básico para os demais tratamentos, com exceção do SVE, onde não foi adicionado o álcool polivinílico (PVA). Os CCOs foram mantidos na presença de PMA por 1, 4 e 7 horas, sendo após, transferidos para o meio básico de maturação até que se completassem 24 horas de cultivo. A estimulação da PQ-C, por esses períodos, não alterou a formação de prónúcleos, porém, diminuiu a percentagem de clivagem dos zigotos. Os resultados do grupo 4α-PDD comprovam que as alterações ocorridas no grupo PMA são devido à ativação da PQ-C e não ação direta do forbol éster na célula. A análise da composição protéica demonstrou uma banda de proteína adicional no grupo SVE ao redor de 74 kilo Daltons (kDa). Os resultados desse estudo, quando associados aos dados preliminares de Western blot, indicam a importância da PQ-C na regulação da maturação, fecundação e clivagem de embriões bovinos. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACTIn the present study the pronucleus formation, cleavage and protein profile after protein kinase C (PK-C) activation were evaluated during bovine oocyte maturation. A total number of 1936 bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly distributed in 4 treatments, and matured with PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, PK-C activator), 4α- PDD (100nM de 4α-phorbol 12,13-didecanoetate, phobol ester that do not bind on PK-C, phorbol ester control), ECS (10% of estrus cow serum, positive control) and in a negative control (basic maturation media for all treatments, except on ECS group where the polyvinyl alcohol was not added). The COCs were kept in presence of PMA for 1, 4 or 7 hours and then transferred to basic maturation media until the 24 hours maturation period was completed. The PK-C stimulation in these periods did not alter the pronucleus formation but caused a decrease in the zygotes cleavage rate. The 4α-PDD group results showed that the alterations in PMA group were caused by PK-C activation and not by direct phorbol ester action on the cell. The protein composition analysis showed an additional protein band on ECS group around 74 kilo Daltons (kDa). Altogether, these results with the preliminary Western Blot analysis, indicate an important role of PK-C on bovine oocyte maturation, fertilization and embryo cleavage

Platelet-derived growth factor, retinol and insulin in the regulation of bovine oocyte nuclear maturation and their consequent effect in the embryonic development

O objetivo deste trabalho foi verificar as ações do fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF; P), da insulina (I), do retinol (R) e de suas associações (PI, PIR, IR e PR) na maturação nuclear (MN) de oócitos bovinos e suas conseqüências no desenvolvimento embrionário (DE). O meio básico para maturação dos oócitos nos diferentes tratamentos foi o TCM-199 modificado acrescido de PVA (controle). No DE, foram utilizados os grupos R, PIR, IR, um controle negativo (PVA) e um controle positivo, contendo soro fetal bovino e gonadotrofinas (SFBHOR). Os fatores P, I, R e suas associações não aceleraram a MN em 7h mas sim após 18h (P<0,001), com exceção dos tratamentos R e PR, nos quais as percentagens de metáfase II foram, respectivamente, de 4,7% e 8,3%, similares à obtida no grupo-controle (0,0%). Considerando um nível de significância de P<0,0001 em comparação ao grupocontrole, os maiores índices de metáfase II foram obtidos na presença das associações IR (19,0%) e PIR (21,3%). No DE, R (18,3%), PIR (13,9%) e IR (10,6%) incrementaram os índices de clivagem, comparados ao PVA (0,0%; P<0,001), porém não atingiram os índices do grupo SFBHOR (53,8%; P<0,001). Conclui-se que insulina e PDGF aceleram a MN e suas ações são potencializadas pelo retinol. Os índices de clivagem de oócitos maturados na presença de R, IR e PIR são superiores aos do PVA, mas significativamente inferiores aos maturados em SFBHOR. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe aim of the present study was to determine the effect of platelet-derived growth factor (PDGF; P), insulin (I) retinol, (R) and their interactions (PI, PIR, IR and PR) on oocyte nuclear maturation (NM) and, consequent, embryonic development (ED). The basic medium for oocyte maturation in the treatments was the modified TCM-199, supplemented with PVA (control). To study the embryonic development, the oocytes were divided in three treatments, R, PIR e IR, a negative (PVA) and a positive control group (containing calf fetal serum and gonadotrophic hormones; FCSHOR). The PDGF, insulin, retinol and their interactions did not change the kinetic of the NM, in seven hours of culture (P=0.4492) but it changed after 18 hours of maturation (P<0.001) except in the treatments R and PR (P<0.001), in which the percentages of metaphase II were, respectively, 4.7% and 8.3%. These results were similar to the control group (0.0%). Considering a significant level of P<0.0001 in comparison to the control group, the higher rates of metaphase II were obtained in the presence of IR (19.0%) and PIR (21.3%). The higher rates of MII were observed when the oocytes were matured in the presence of insulin and retinol. In the embryonic development, R (18.3%), PIR (13.9%) and IR (10.6%) increased the rate of cleavage when compared to PVA group (0.0%; P<0.001). However, the oocytes were not competent enough to reach the rate obtained in the FCSHOR group (53.8%; P<0.001). In conclusion, insulin and PDGF accelerate NM and their effects are enhanced by retinol. In the embryonic development, oocytes matured in the presence of either R, IR or PIR have higher cleavage rate than PVA group but lower than those matured in the FCSHOR group

Meios congelados na produção de embriões in vitro em bovinos

A produção de embriões bovinos in vitro (PIV), atualmente, é laboriosa, apresenta custo relativamente elevado e alta variabilidade nos resultados. No sentido de torná-la mais simples, obter maior repetição nos resultados, diminuir custo e facilitar a sua utilização a campo, foram delineados experimentos para avaliar a eficácia de um sistema para PIV utilizando meios preservados pela congelação. Inicialmente, em 3 replicações, um total de 534 oócitos foram divididos em dois grupos. No grupo tratamento, os meios utilizados na PIV (meio de maturação, Fert-TALP, sp-TALP 1x, sp-TALP 10x e KSOM modificado) foram preservados a -19oC e no grupo controle, utilizou-se meios refrigerados a 5oC e armazenados por no máximo 15 dias. Foi, também, verificado se ocorreram interações moleculares associativas nos meios devido à congelação, para isso foram realizadas varreduras espectrais em cada meio, antes da congelação e após 15, 30, 150 dias de preservação a -19oC. A maturação, a fecundação e o cultivo embrionário foram efetuados em TCM-199 modificado, Fert-TALP e KSOM modificado, respectivamente, em estufa a 39oC com 5% de CO2 e umidade saturada. As percentagens de clivagem, de blastocistos expandidos (Bx)/oócitos e de Bx/clivados no grupo tratamento (73,5%; 17,5%; 23,9%, respectivamente) foram similares às obtidas no grupo controle (76,3%; 18,8%; 24,6%, respectivamente). Não se observaram modificações significativas nos meios, do ponto de vista de interações moleculares associativas, nas diferentes etapas examinadas pelas varreduras espectrais. A utilização de um sistema para PIV com meios preservados por congelação não diminui a produção de embriões quando comparado ao sistema convencional. Esse sistema possibilita, também, a escolha das melhores partidas, as quais podem ser utilizadas por um longo período, fornecendo assim, melhores resultados com menor variabilidade. Além disso, o processo de produção de embriões in vitro fica mais prático, eficaz, econômico e acessível aos laboratórios menos equipados

Hepes na produção de embriões bovinos in vitro Hepes on in vitro production of bovine embryos

O objetivo do presente estudo foi de avaliar a amplitude da variação de pH em meios de maturação e de cultivo embrionário, com diferentes concentrações do tampão HEPES. Inicialmente, foi determinado o efeito de diferentes concentrações de HEPES (0, 12,5 e 25,0mM) na variação do pH dos meios de maturação (TCM-199 modificado) e desenvolvimento embrionário (KSOM modificado) em meio ambiente, à temperatura de 25ºC, e na estufa, em uma atmosfera de 5% de CO2 em ar a 39ºC. Em um segundo experimento, os oócitos foram maturados em TCM-199 modificado sem HEPES (142 oócitos) ou com 25,0mM de HEPES (137 oócitos) e foi avaliado índice de blastocisto. O meio Fert-TALP foi utilizado para a fecundação, sendo que os embriões foram co-cultivados com células epiteliais de oviduto (CEO) em KSOM modificado com 10% de SFB. Um terceiro experimento foi delineado para determinar a importância da presença do HEPES no meio de cultivo embrionário sobre o desenvolvimento de embriões bovinos in vitro. Para isso, após a retirada do cumulus, os zigotos foram divididos ao acaso e co-cultivados com CEO em KSOM modificado (com 10% de SFB) sem HEPES (grupo controle; n = 95) ou com 25,0mM de HEPES (grupo HEPES; n = 92). Foram mantidos em cultivo somente os embriões com duas ou mais células, sendo considerados desenvolvidos os que atingiram o estádio de blastocisto expandido (Bx), 7 e 9 dias após inseminação. O cultivo dos oócitos e embriões, em ambos os experimentos, foi efetuado em estufa a 39ºC, com uma atmosfera contendo 5% de CO2 e umidade saturada. Os resultados mostram que os meios contendo 25,0mM de HEPES foram mais eficientes em minimizar a variação do pH que os meios com 12,5mM ou sem HEPES. Além disso, a adição de HEPES ao meio de maturação aumentou os índices de Bl sobre o total de oócitos e sobre o total de clivados (21,9% e 42,86%) com relação ao controle (10,56 e 16,67%; p<0,05). Na determinação da importância do HEPES no desenvolvimento embrionário, o grupo HEPES apresentou índices superiores de Bx (45,65%) em relação ao controle (11,58%; p<0,01). A uniformidade dos resultados foi um dos aspectos positivos observados quando o HEPES estava presente no meio de cultivo embrionário. Portanto, o uso do HEPES, durante a maturação e o cultivo embrionário, é recomendável para o aumento da produção de embriões in vitro com maior repetibilidade.<br>The aim of the present study was to evaluate the range of pH changes in maturation and embryo development media, buffered with different HEPES concentrations. Initially, the effect of different concentrations of HEPES (0, 12.5 and 25.0mM) on the variation of pH in the maturation (modified TCM-199) and embryonic development (modified KSOM) media was evaluated at room temperature (25ºC) and in an atmosphere of 5% CO2 in air at 39ºC. In another experiment, the effect of HEPES on in vitro oocyte maturation was determined. Oocytes were maturated in TCM-199 modified either with 25.0mM of HEPES (HEPES group; n = 137) or without HEPES (control group; n = 142), performing 7 replicates and evaluating the rate of blastocyst. In this study, the medium used for fertilization was Fert-TALP while for embryo development was KSOM with 10% of fetal bovine serum with monolayer of oviduct epithelial cells. A third experiment was designed to determine the effect of HEPES on embryo development. The zygotes were divided in two groups and co-incubated with oviduct epithelial cells in modified KSOM with 10% of fetal bovine serum without HEPES (n = 95) or with 25.0mM of HEPES (n = 92). For this experiment, it was used embryos with two or more cells and the embryo development was considered from cleavage to expanded blastocyst (Bx), 7 and 9 days after insemination. The oocytes and embryos were incubated at temperature of 39ºC, an atmosphere containing 5% CO2 in air and saturated humidity. The media with 25.0mM of HEPES were more efficient in minimizing the range of pH than those with 12.5mM or without HEPES. To determine the effect of HEPES during in vitro oocyte maturation, the percentage of Bl considered either the total number of oocytes or the total number of cleavages was higher in the HEPES group (21.9% or 42.9%, respectively) than those obtained in the control group (10.56% or 16.67%, respectively). When HEPES was added to embryo culture medium, the percentage of Bx (45.65%) was higher than that obtained in medium without HEPES (11.58%; p<0.01). The variability between replicates was lower when HEPES was present in embryo development medium, comparing to the medium without HEPES. Therefore, HEPES is an important compound to be present in media for oocyte maturation and embryo development, increasing the in vitro production of bovine embryos

Fecundação e clivagem após a ativação da proteína quinase C durante a maturação de oócitos bovinos Fertilization and cleavage after protein kinase C activation during bovine oocyte maturation

A formação de pró-núcleos, clivagem e perfil protéico foram avaliados após a ativação da proteína quinase C (PQ-C) durante a maturação de complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. Visando a determinar estes efeitos da PQ-C, 1936 CCOs foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, sendo maturados na presença de PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, ativador da PQ-C), de 4alfa-PDD (100nM de 4alfa-phorbol 12,13-didecanoetate, forbol éster que não ativa a PQ-C; controle forbol éster), de SVE (10% de soro de vaca em estro, controle positivo) e de um controle negativo constituído pelo meio de maturação básico para os demais tratamentos, com exceção do SVE, onde não foi adicionado o álcool polivinílico (PVA). Os CCOs foram mantidos na presença de PMA por 1, 4 e 7 horas, sendo após, transferidos para o meio básico de maturação até que se completassem 24 horas de cultivo. A estimulação da PQ-C, por esses períodos, não alterou a formação de pró-núcleos, porém, diminuiu a percentagem de clivagem dos zigotos. Os resultados do grupo 4alfa-PDD comprovam que as alterações ocorridas no grupo PMA são devido à ativação da PQ-C e não ação direta do forbol éster na célula. A análise da composição protéica demonstrou uma banda de proteína adicional no grupo SVE ao redor de 74 kilo Daltons (kDa). Os resultados desse estudo, quando associados aos dados preliminares de Western blot, indicam a importância da PQ-C na regulação da maturação, fecundação e clivagem de embriões bovinos.<br>In the present study the pronucleus formation, cleavage and protein profile after protein kinase C (PK-C) activation were evaluated during bovine oocyte maturation. A total number of 1936 bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly distributed in 4 treatments, and matured with PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, PK-C activator), 4alpha-PDD (100nM de 4alpha-phorbol 12,13-didecanoetate, phobol ester that do not bind on PK-C, phorbol ester control), ECS (10% of estrus cow serum, positive control) and in a negative control (basic maturation media for all treatments, except on ECS group where the polyvinyl alcohol was not added). The COCs were kept in presence of PMA for 1, 4 or 7 hours and then transferred to basic maturation media until the 24 hours maturation period was completed. The PK-C stimulation in these periods did not alter the pronucleus formation but caused a decrease in the zygotes cleavage rate. The 4alpha-PDD group results showed that the alterations in PMA group were caused by PK-C activation and not by direct phorbol ester action on the cell. The protein composition analysis showed an additional protein band on ECS group around 74 kilo Daltons (kDa). Altogether, these results with the preliminary Western Blot analysis, indicate an important role of PK-C on bovine oocyte maturation, fertilization and embryo cleavage