Anti-Trichomonas vaginalis activity of marine-associated fungi from the South Brazilian Coast

AbstractTrichomonas vaginalis is the causative agent of trichomonosis, the most common non-viral sexually transmitted disease. Infection with this protozoan may have serious consequences, especially for women. Currently, 5-nitroimidazole drugs are the treatment of choice for trichomonosis, but the emergence of resistance has limited the effectiveness of this therapy. In this context, this study aimed to evaluate the anti-T. vaginalis activity of marine-associated fungi found in the South Brazilian Coast. A total of 42 marine-associated fungal species (126 filtrate samples) isolated from 39 different marine organisms, mainly sponges, were selected to be screened against T. vaginalis. Of these, two filtrate samples from Hypocrea lixii F02 and Penicillium citrinum F40 showed significant growth-inhibitory activity (up to 100%) against ATCC 30236 and fresh clinical isolates, including a metronidazole-resistant isolate. Minimum inhibitory concentration (MIC) values of H. lixii F02 and P. citrinum F40 samples for all isolates tested, including the metronidazole-resistant isolate, were 2.5mg/mL. The kinetic growth curve showed that the filtrate samples were able to reduce the density of parasites to zero within 24h of incubation, which was confirmed by microscopy. Both fungal filtrate samples exhibited no hemolytic activity, and the P. citrinum F40 filtrate sample showed low cytotoxicity against Vero cells. These data suggest that marine-associated fungi from the South Brazilian Coast may produce potential candidates for further investigation and possible use in the treatment of metronidazole-resistant trichomonosis

Susceptibilidade antifúngica em biofilme de Candida isolada a partir da urina pacientes ambulatoriais

Background and Objectives: the association between the biofilm formations an antifungal resistance has been suggested to be an important factor in the pathogenesis of several Candida species. Besides, studies have included invasive candidiasis from hospitalized patients; however there are few studies that evaluated the species distribution, antifungal susceptibility and biofilm formation of Candida species isolated from ambulatory patients. Thus, the aim of this study was to evaluate whether biofilm producing contributes to antifungal resistance in Candida isolates from urine sample obtained from ambulatory patients. Methods: During one year, 25 urine samples positive for yeast were collected, stored and plated on agar supplemented with chloramphenicol and Sabouread left at room temperature for 5 days for subsequent: 52% (13/25) were C. albicans, 36% (9/25) C. tropicalis, 8% (2/25) C. krusei and 4% (1/25) C. parapsilosis. Results: The ability to form biofilm was detected in 23 (92%) of the yeast studied and 15.4% (2/13) of C. albicans were fluconazole (FLU) and ketoconazole (KET) resistant, while 11.1% (1/9) of C. tropicalis were ketoconazole resistant and were anidulafungin (ANI) non-susceptible. Conclusion: our results showed the high capacity for biofilm formation among Candida isolates from ambulatory patients.Justificativa e objetivos: a associação entre as formações biofilme uma resistência antifúngica foi sugerido para ser um fator importante na patogênese de diversas espécies de Candida. Além disso, estudos têm incluído candidíase invasiva de pacientes hospitalizados; no entanto, existem poucos estudos que avaliaram a distribuição das espécies, suscetibilidade aos antifúngicos e formação de biofilme de espécies de Candida isoladas de pacientes ambulatoriais. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar se a produção de biofilme contribui para a resistência antifúngica em Candida isoladas de amostras de urina obtidas de pacientes de ambulatório. Métodos: Durante um ano, 25 amostras de urina positivas para leveduras, foram coletadas, armazenadas e semeadas em agar Sabouread suplementado com cloranfenicol e deixadas a temperature ambiente por 5 dias, para posterior identificação: 52% (13/25) foram C. albicans, 36% (9/25) C. tropicalis, 8% (2/25) C. krusei e 4% ( 1/25) C. parapsilosis. Resultados: A capacidade de formar biofilme foi detectada em 23 (92%) da levedura estudados e 15,4% (2/13) de C. albicans foram fluconazol (FLU) e cetoconazol (PET) resistente, enquanto que 11,1% (1/9 ) de C. tropicalis foram resistentes cetoconazol e foram anidulafungina (ANI) não-suscetíveis. Conclusão: nossos resultados mostraram a alta capacidade de formação de biofilme entre Candida isoladas de pacientes ambulatoriais. Conclusão: nossos resultados mostraram a alta capacidade de formação de biofilme entre Candida isoladas de pacientes ambulatoriais

Modulatory effect of iron chelators on adenosine deaminase activity and gene expression in Trichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitises the urogenital human tract and causes trichomoniasis. During the infection, the acquisition of nutrients, such as iron and purine and pyrimidine nucleosides, is essential for the survival of the parasite. The enzymes for purinergic signalling, including adenosine deaminase (ADA), which degrades adenosine to inosine, have been characterised in T. vaginalis. In the evaluation of the ADA profile in different T. vaginalis isolates treated with different iron sources or with limited iron availability, a decrease in activity and an increase in ADA gene expression after iron limitation by 2,2-bipyridyl and ferrozine chelators were observed. This supported the hypothesis that iron can modulate the activity of the enzymes involved in purinergic signalling. Under bovine serum limitation conditions, no significant differences were observed. The results obtained in this study allow for the assessment of important aspects of ADA and contribute to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and the role of iron in establishing infection and parasite survival

Estudo da expressão gênica das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (e-ntpdases) em trichomonas vagilalis e participação da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro

Introdução: Trichomonas vaginalis é um protozoário extracelular, agente etiológico da tricomonose, a mais prevalente doença sexualmente transmissível (DST) não viral no mundo. A citoaderência tem sido um dos mecanismos de patogenicidade mais estudados, porém, pouco se avaliou sobre a adesão do T. vaginalis a superfícies abióticas e, até o presente momento, não foi determinado se o T. vaginalis adere a dispositivos intrauterinos (DIU) e ao anel vaginal. Objetivos: (i) avaliar a capacidade de adesão do T. vaginalis às diferentes superfícies abióticas e estudar os mecanismos envolvidos nesse processo; (ii) comparar os mecanismos envolvidos na citoaderência com os de adesão a superfícies abióticas. No decorrer do estudo, ficou evidenciada a necessidade de inclusão de dois objetivos: (a) uma revisão sistemática da literatura científica para determinar as estimativas de prevalência e incidência da tricomonose no mundo; (b) determinar a estabilidade de genes candidatos a genes de referência para a utilização como housekeeping genes nos ensaios de expressão gênica. Métodos: Foi realizada uma revisão sistemática, seguindo as normas do PRISMA guidelines, para avaliar números atuais de prevalência e incidência da tricomonose no mundo. Com relação à estabilidade de genes candidatos a genes de referência, nove tiveram seus níveis de expressão constitutiva avaliados quando cultivados sob limitação e suplementação de nutrientes. Trinta e dois isolados de T. vaginalis foram avaliados quanto à capacidade de adesão ao plástico, pelo método de cristal violeta em placas de poliestireno. Na sequência, foram selecionados, aleatoriamente, dois isolados que apresentaram forte adesão ao plástico para serem utilizados como modelo de estudo dos mecanismos de citoaderência às células epiteliais vaginais (CEVs) e adesão às superfícies abióticas (DIU e anel vaginal). Os isolados de T. vaginalis TV-LACM6 e TV-LACM14 foram tratados com meta-periodato, colchicina, tripsina, citochalasina e metronidazol e reavaliados quanto à capacidade de adesão e citoaderência. Foram determinados os níveis de expressão gênica de quatro adesinas (AP33, AP51, AP65 e AP120) em trofozoítos aderidos em placas de poliestireno e às CEVs. Os isolados ATCC 30236, TV-LACM6 e TV-LACM14 foram usados na determinação da adesão ao DIU e ao anel vaginal e a adesão a esses dispositivos foi confirmada por microscopia confocal. Resultados: A revisão sistemática da literatura demonstrou que são raros os estudos quanto à prevalência e incidência da tricomonose no mundo. Reafirma-se, portanto, a posição da tricomonose como uma doença parasitária negligenciada. Dentre os nove candidatos a genes de referência (actina, F-actina (β e α), tubulina (α, β e γ), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, fator de elongamento e DNA topoisomerase II), os genes α-tubulina, actina e DNATopII foram os mais estáveis, nas condições de limitação de nutrientes. Dos 32 isolados avaliados, 59 (35%) aderiram ao plástico. Após os tratamentos químicos observou-se que os isolados TV-LACM6 e TV-LACM14 reduziram os níveis de adesão tanto às CEVs quanto ao plástico, demonstrando que o T. vaginalis realiza a patogênese através de adesão e citoaderência por múltiplos mecanismos, os quais envolvem a participação do lipofosfoglicano e proteínas de membrana. Na análise da expressão gênica constatou-se que nos trofozoítos aderidos às CEVs houve aumento na expressão das quatro adesinas (AP33, AP51, AP65 e AP120). Por outro lado, nos trofozoítos aderidos ao plástico não existiu aumento nos níveis de expressão desses genes. Os isolados TV-LACM6 e TV-LACM14 aderiram ao DIU e ao anel vaginal, já o isolado ATCC 30236 apresentou praticamente nula adesão a tais dispositivos. Conclusões: Considerando a revisão sistemática da literatura constatou-se que existem poucos estudos, com qualidade metodológica, quanto à prevalência e incidência da tricomonose, assim pouco se sabe sobre a realidade epidemiológica dessa doença. A validação de genes de referência originou o primeiro relato deste tipo de estudo em T. vaginalis, no qual demonstramos que os genes mais estáveis foram αtubulina, actina e DNATopII; por outro lado, os mais instáveis foram GAPDH e βtubulina. Em relação ao estudo da adesão de T. vaginalis a superfícies abióticas concluímos que os trofozoítos de T. vaginalis aderem no DIU e ao anel vaginal e é inédita a descrição desse fenômeno. Ao analisarmos os mecanismos envolvidos na adesão e citoaderência concluímos que o LPG tem um papel importante em ambos os processos, por outro lado, as adesinas de superfície parecem não estar envolvidas na adesão a superfícies abióticas (plástico). Finalmente, nossos resultados reafirmam a importância do T. vaginalis como um importante problema para mulheres em idade reprodutiva, pois, a adesão aos dispositivos contraceptivos poderá facilitar a infecção. Além disso, nossos resultados indicaram uma possível diferença entre o processo de citoaderência e adesão ao plástico, uma vez que uma maior expressão das adesinas foi observado somente entre os trofozoítos aderidos às células epiteliais vaginais. No entanto, o LPG parece ser importante tanto na citoaderência quanto na adesão ao plástico, uma vez que a oxidação do LPG reduziu de forma similar e de forma significativa a citoaderência e a adesão. Esses resultados indicam que o T. vaginalis possui um complexo mecanismo de citoaderência e adesão que garantirá o sucesso do parasitismo.Introduction: Trichomonas vaginalis is an extracellular protozoan and the etiologic agent of trichomonosis, the most prevalent sexually transmitted disease in the world. Cytoadherence has been the most studied pathogenic mechanism, however, there are few studies about adherence to plastic by T. vaginalis and to the best of our knowledge no study has evaluated the T. vaginalis adhesion to intrauterine device (IUD) and vaginal ring. Objectives: (i) to conduct a systematic review in order to determine both prevalence and incidence values of trichomonosis among general population from fivecontinent regions; (ii) to determine the stability from candidate reference genes for use in gene expression normalization; (iii) to evaluated the ability of T. vaginalis fresh isolates to adhere to plastic, host cells and contraceptive devices; (iv) to compare the mechanism involved in adhesion to plastic and cytoadherence processes. Methods: We conducted a systematic review of the literature following PRISMA guidelines. The transcripts of nine candidate reference genes were quantified using qRT-PCR under different cultivation conditions, and the stability of these genes was compared using the geNorm and NormFinder algorithms. Herein we investigated the adherence ability of T. vaginalis fresh clinical isolates to plastic, IUD and vaginal ring. The influence of LPG, cytoskeletal components of the parasite, surface molecules and the gene expression from four adhesins proteins were also investigated in the cytoadherence to human cells and in adhesion to plastic. . Results: The systematic review showed that the most robust data were found in the US; in the other hand other regions have limited numbers of studies, thus the data obtained in this review point that the overall burden of trichomonosis in world as a whole is still unknown. In the validation of reference genes, the most stable genes were α-tubulin, actin and DNATopII, and, conversely, the widely used T. vaginalis reference genes GAPDH and β-tubulin were less stable. Of 32 T. vaginalis isolates studied here, 19 (59.37%), were able to adhere in polystyrene microplates. The T. vaginalis isolates TV-LACM6 and TV-LACM14, which were strong plastic-adherent, were also able to adhere to IUD and vaginal ring. Following chemical treatments, the T. vaginalis components, LPG, cytoskeletal proteins and other surface molecules, were involved in both adherence to plastic and cytoadherence. The gene expression level from four adhesins proteins were highest in trophozoites adhered in CEVs than in trophozoites adhered to the abiotic surface (plastic). Conclusions: Few data about the numbers of prevalence and incidence of trichomonosis are available, consequently robust epidemiological studies of prevalence and incidences showing the disease ongoing are needed to guide priorities and define public health policies. Considering the validation of reference genes, this study is the first systematic exploration of T. vaginalis to identify optimal reference genes for qRT-PCR normalization under different culture conditions. This is valuable for future research on T. vaginalis gene expression studies. Finally, our results reaffirm the importance of T. vaginalis as an important problem among women in reproductive age, because the trophozoites were able to adhere in contraceptive devices and this fact could facilitate the parasite infection in the vaginal cavity. Moreover, our results indicate a possible difference between cytoadherence process and adhesion to plastic, subsequently the high level of adhesin protein expression were observed only in trophozoites attached to VECs. However, the LPG appears to be important in both processes, since the oxidation of LPG similarly and significantly reduced the adherence and cytoadherence. These results indicate that T. vaginalis presents multiple and complex mechanisms for attachment to host cells and to abiotic surfaces, ensuring successful parasitism

« L’intervention sociologique de longue durée, un récit itératif »

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Optimal Reference Genes for Gene Expression Normalization in <i>Trichomonas vaginalis</i>

<div><p><i>Trichomonas vaginalis</i> is the etiologic agent of trichomonosis, the most common non-viral sexually transmitted disease worldwide. This infection is associated with several health consequences, including cervical and prostate cancers and HIV acquisition. Gene expression analysis has been facilitated because of available genome sequences and large-scale transcriptomes in <i>T</i>. <i>vaginalis</i>, particularly using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), one of the most used methods for molecular studies. Reference genes for normalization are crucial to ensure the accuracy of this method. However, to the best of our knowledge, a systematic validation of reference genes has not been performed for <i>T</i>. <i>vaginalis</i>. In this study, the transcripts of nine candidate reference genes were quantified using qRT-PCR under different cultivation conditions, and the stability of these genes was compared using the geNorm and NormFinder algorithms. The most stable reference genes were <i>α-tubulin</i>, <i>actin</i> and <i>DNATopII</i>, and, conversely, the widely used <i>T</i>. <i>vaginalis</i> reference genes <i>GAPDH</i> and <i>β-tubulin</i> were less stable. The <i>PFOR</i> gene was used to validate the reliability of the use of these candidate reference genes. As expected, the <i>PFOR</i> gene was upregulated when the trophozoites were cultivated with ferrous ammonium sulfate when the <i>DNATopII</i>, <i>α-tubulin</i> and <i>actin</i> genes were used as normalizing gene. By contrast, the <i>PFOR</i> gene was downregulated when the <i>GAPDH</i> gene was used as an internal control, leading to misinterpretation of the data. These results provide an important starting point for reference gene selection and gene expression analysis with qRT-PCR studies of <i>T</i>. <i>vaginalis</i>.</p></div

Expression stability values (<i>M</i>) and ranking of the candidate reference genes based on geNorm calculation.

<p><b>(a)</b> total samples; <b>(b)</b> samples under all nutrient restriction; <b>(c)</b> samples with 1% HIBS; <b>(d)</b> maltose restriction; <b>(e)</b> HIBS and maltose restriction; <b>(f)</b> samples supplemented with 200 μM ferrous ammonium sulfate. The <i>M</i> value and ranking were calculated through a pairwise comparison and stepwise exclusion of the lowest stable gene. Low <i>M</i> values correspond to high expression stability.</p

Gene ID, gene symbol, primer sequence and amplicon length of the selected reference genes.

<p>Gene ID, gene symbol, primer sequence and amplicon length of the selected reference genes.</p