Transfecção de DNA de BoHV-5 com fosfato de cálcio em diferentes tipos de cultivos celulares

As condições para uma transfecção eficaz pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi testado o tipo de cultivo celular mais apropriado para transfecção de DNA de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) por esta técnica. Primeiramente foi avaliada a capacidade de multiplicação do BoHV-5 em três diferentes tipos de células. Para isto, a concentração viral foi calculada pelo método de dose infectante para cultivo celular / 50% (TCID  50/mL). O BoHV-5 foi titulado em células de linhagem de rim de macaco verde Africano (VERO), células de linhagem de rim de suíno (PKsC3), células primárias de testículos de terneiro (TT) e células de linhagem de rim de bovino (MDBK). Em células VERO e PKsC3 a concentração viral máxima obtida foi 103,3 TCID50/mL, enquanto que em células MDBK o título foi de 106,8 TCID50/mL, similar ao encontrado para as células TT. Para avaliar a eficácia da transfecção nessas células, foi utilizado DNA plasmideal expressando um gene repórter (EGFP). Os resultados mostraram um valor de 4,5% de células fluorescentes para células TT, de 2,9% para PKsC3, de 0,5% para VERO e de 0,05% para MDBK. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 ?g de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo, com duas placas virais por poço. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 ?g e 1 ?g de DNA purificado de BoHV-5, produzindo duas e quatro placas, respectivamente. Nas condições experimentais testadas neste estudo os resultados indicam que as células TT poderiam ser boas candidatas para serem utilizadas para a transfecção de DNA de BoHV-5

Standardization of a method for transfection of bovine herpes virus dna by calcium phosphate using different cell types

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula.The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell

Standardization of a method for transfection of bovine herpes virus dna by calcium phosphate using different cell types

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula.The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell

Transfection of BoHV-5 DNA with calcium phosphate in different types of cell culture

As condições para uma transfecção eficaz pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi testado o tipo de cultivo celular mais apropriado para transfecção de DNA de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) por esta técnica. Primeiramente foi avaliada a capacidade de multiplicação do BoHV-5 em três diferentes tipos de células. Para isto, a concentração viral foi calculada pelo método de dose infectante para cultivo celular / 50% (TCID50/mL). O BoHV-5 foi titulado em células de linhagem de rim de macaco verde Africano (VERO), células de linhagem de rim de suíno (PKsC3), células primárias de testículos de terneiro (TT) e células de linhagem de rim de bovino (MDBK). Em células VERO e PKsC3 a concentração viral máxima obtida foi 103,3 TCID50/mL, enquanto que em células MDBK o título foi de 106,8 TCID50/mL, similar ao encontrado para as células TT. Para avaliar a eficácia da transfecção nessas células, foi utilizado DNA plasmideal expressando um gene repórter (EGFP). Os resultados mostraram um valor de 4,5% de células fluorescentes para células TT, de 2,9% para PKsC3, de 0,5% para VERO e de 0,05% para MDBK. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 μg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo, com duas placas virais por poço. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 μg e 1 μg de DNA purificado de BoHV-5, produzindo duas e quatro placas, respectivamente. Nas condições experimentais testadas neste estudo os resultados indicam que as células TT poderiam ser boas candidatas para serem utilizadas para a transfecção de DNA de BoHV-5.The conditions for an efficacious transfection by calcium phosphate method can vary substantially. In this study the most appropriate cell type for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) DNA using this technique was tested. It was first evaluated the capacity of BoHV-5 multiplication in three different cell types. For this purpose virus concentration was calculated by tissue culture infectious dose 50% assay (TCID50/mL). BoHV-5 was titrated in kidney cells from African green monkey (VERO), cell clone of pig kidney (PKsC3), primary cell culture of calf testis (TT) and bovine kidney cells (MDBK). In Vero and PK15 cells maximum virus concentration reached 103,3 TCID50/mL, whereas in MDBK cells the titre was 106,8 TCID50/mL, similar to that of TT cells. In order to evaluate the transfection efficacy in these cells, plasmid DNA expressing a reporter gene (EGFP) was used. Results showed 4.5% fluorescent cells for TT, 2.9% for PKsC3, 0.5% for VERO and 0.05% for MDBK cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5 mg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two plaques per well. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were then transfected with 0.5 mg and 1.0 mg of purified BoHV-5 DNA producing two and four plaques, respectively. Under experimental conditions tested in this study the results indicate that TT cells could be good candidates to be used for transfection of BoHV-5 DNA

ENSAIOS SOBRE O ALONGAMENTO DE BROTOS DE Dyckia maritima Baker DISPOSTOS EM AGRUPAMENTOS - BROMELIACEAE

Agrupamentos de brotos laterais de Dyckia maritima obtidos por organogênese direta, apresentam dificuldade de manipulação durante a repicagem devido ao seu tamanho reduzido. O objetivo deste trabalho foi determinar um meio de cultura para o alongamento de brotos laterais dispostos em agrupamentos. Brotos laterais de Dyckia maritima foram submetidos a três diferentes experimentos. Um dos experimentos foi conduzido com as variações de 25, 50 e 100% da concentração de sais do meio de Murashige e Skoog (1962). Dois experimentos foram realizados com uso do ácido giberélico (GA3), sendo o primeiro com as concentrações de 0; 0,25; 0,5 e 1,0 mg L-1 e o segundo com as concentrações de 0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ou 5,0 mg L-1 de GA3. No experimento da variação de concentrações de sais do meio MS foi verificado um decréscimo da média do comprimento dos brotos e um decréscimo do incremento de massa em relação a diluição da concentração de sais do meio MS. No primeiro teste do experimento com ácido giberélico foi verificado que a média do comprimento dos brotos seguiu uma regresssão linear positiva, sugerindo um novo experimento com concentrações mais elevadas, porém o incremento de massa fresca apresentou uma regressão quadrática. No segundo teste com concentrações mais elevadas de GA3, a média do comprimento de brotos apresentou uma regressão quadrática, tendo a sua máxima eficiência técnica de 2,6 mg L-1 de GA3

Guaraná (Paullinia cupana) improves the proliferation and oxidative metabolism of senescent adipocyte stem cells derived from human lipoaspirates

AbstractCellular senescence is a limiting factor in the proliferative expansion and quality of adult mesenchymal stem cells, often making them unviable in regenerative clinical practice. In vitro supplementation by antioxidant food extract of senescent mesenchymal stem cells could reverse these undesirable characteristics. To evaluate this hypothesis, senescent adipocyte-mesenchymal cells (ASCs) obtained from human lipoaspirates were exposed at different concentrations of hydro-alcoholic guaraná (Paullinia cupana) extract for 72h. After the incubation, we performed a proliferative assay. Oxidative stress indicators and antioxidant enzymes (biochemical activity and gene expression by qRT-PCR analysis) in these senescent cells were also evaluated. In senescent cells exposed to guaraná at 5mg/g concentration increased cellular proliferation occurred compared to untreated senescent cells (79.1±15.7%). Concomitantly, a decrease in several oxidative stress indicators was observed in senescent cells treated with guaraná. A genomic effect of guaraná exposure was observed when the modulation of antioxidant enzymes genes was analyzed. The results described here suggest that the food extract supplementation could reverse the initial senescence processes in ASCs. These results have potential application in regenerative medicine

Methotrexate-related response on human peripheral blood mononuclear cells may be modulated by the Ala16Val-SOD2 gene polymorphism.

Methotrexate (MTX) is a folic acid antagonist used in high doses as an anti-cancer treatment and in low doses for the treatment of some autoimmune diseases. MTX use has been linked to oxidative imbalance, which may cause multi-organ toxicities that can be attenuated by antioxidant supplementation. Despite the oxidative effect of MTX, the influence of antioxidant gene polymorphisms on MTX toxicity is not well studied. Therefore, we analyzed here whether a genetic imbalance of the manganese-dependent superoxide dismutase (SOD2) gene could have some impact on the MTX cytotoxic response. An in vitro study using human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from carriers with different Ala16Val-SOD2 genotypes (AA, VV and AV) was carried out, and the effect on cell viability and proliferation was analyzed, as well as the effect on oxidative, inflammatory and apoptotic markers. AA-PBMCs that present higher SOD2 efficiencies were more resistance to high MTX doses (10 and 100 µM) than were the VV and AV genotypes. Both lipoperoxidation and ROS levels increased significantly in PBMCs exposed to MTX independent of Ala16Val-SOD2 genotypes, whereas increased protein carbonylation was observed only in PBMCs from V allele carriers. The AA-PBMCs exposed to MTX showed decreasing SOD2 activity, but a concomitant up regulation of the SOD2 gene was observed. A significant increase in glutathione peroxidase (GPX) levels was observed in all PBMCs exposed to MTX. However, this effect was more intense in AA-PBMCs. Caspase-8 and -3 levels were increased in cells exposed to MTX, but the modulation of these genes, as well as that of the Bax and Bcl-2 genes involved in the apoptosis pathway, presented a modulation that was dependent on the SOD2 genotype. MTX at a concentration of 10 µM also increased inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNFα and Igγ) and decreased the level of IL-10 anti-inflammatory cytokine, independent of SOD2 genetic background. The results suggest that potential pharmacogenetic effect on the cytotoxic response to MTX due differential redox status of cells carriers different SOD2 genotypes