Phenotypic dissection of the mouse Ren-1(d) knockout by complementation with human renin

Normal renin synthesis and secretion is important for the maintenance of juxtaglomerular apparatus architecture. Mice lacking a functional Ren-1d gene are devoid of renal juxtaglomerular cell granules and exhibit an altered macula densa morphology. Due to the species-specificity of renin activity, transgenic mice are ideal models for experimentally investigating and manipulating expression patterns of the human renin gene in a native cellular environment without confounding Renin-angiotensin-system interactions. A 55 kb transgene encompassing the human renin locus was crossed onto the mouse Ren-1d-null background, restoring granulation in juxtaglomerular cells.  Correct processing of human renin in dense core granules was confirmed by immunogold labelling. After stimulation of the renin-angiotensin system, juxtaglomerular cells contained rhomboid protogranules with paracrystalline contents, dilated rough endoplasmic reticulum and electron-lucent granular structures. However, complementation of Ren-1d-/- mice with human renin was unable to rescue the abnormality seen in macula densa structure. The juxtaglomerular apparatus was still able to respond to tubuloglomerular feedback in isolated perfused juxtaglomerular apparatus preparations, although minor differences in glomerular tuft contractility and macula densa cell calcium handling were observed. This study reveals that the human renin protein is able to complement the mouse Ren-1d-/- non-granulated defect and suggests that granulopoiesis requires a structural motif that is conserved between the mouse Ren-1d and human renin proteins. It also suggests that the altered macula densa phenotype is related to the activity of the renin-1d enzyme in a local juxtaglomerular renin-angiotensin system

Strukturelle Analyse der Reninfreisetzung in juxtaglomerulären Epitheloidzellen

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System ist von übergeordneter Wichtigkeit für die Kontolle des Salz- und Wasserhaushalts des Körpers. Sowohl die Regulation als auch der genaue Mechanismus der Reninsekretion aus den juxtaglomerulären Epitheloidzellen (JG-Zellen) der Niere, wird schon seit geraumer Zeit untersucht. Während zur Regulation der Reninsekretion eine Vielzahl von wissenschaftlichen Arbeiten verfasst wurde, ist der genaue Sekretionsmechanismus noch relativ ungeklärt. Die klassische Mikroskopie mit Hilfe eines Transmissions-elektronenmikroskops (TEM) lieferte bisher wenig Hinweise auf einen klassischen Sekretionsmechanismus, wie beispielsweise Kontakte-von Vesikel- und Zellmembran oder Omega-Strukturen bei JG-Zellen. Darüber hinaus existieren widersprüchliche Angaben hinsichtlich der Morphologie und des Verhaltens der Reninspeichervesikel unter normalen sowie unter extrazellulären Bedingungen, welche die Reninsekretion stimulieren. Zudem liefern statische 2-dimensionale TEM-Aufnahmen nur ein unvollständiges Bild der Vesikelmorphologie und lassen großen Spielraum für Spekulationen. Aus diesem Grund wurden im Zuge dieser Arbeit die Morphologie und der Exozytosemechanismus der Reninspeichervesikel mit Hilfe von aus TEM-Aufnahmen erstellten 3-dimensionalen Teilrekonstruktionen von JG-Zellen untersucht. Die Rekonstruktionen wurden sowohl von Zellen unstimulierter Mausnieren, als auch von Zellen von Mausnieren, deren Reninsekretionsrate mit Hilfe der Arbeitstechnik der isoliert perfundierten Mausniere (IPN) in vivo pharmakologisch stimuliert und gemessen wurde, erstellt. Dabei wurden pro Stimulationsstufe JG-Zellen mehrerer Nieren elektronenmikroskopisch untersucht und daraufhin von maximal zwei repräsentativen Zellen beispielhaft 3-dimensionale Modelle aus TEM-Aufnahmen von 50-100 70 nm dicken Ultradünnschnitten erstellt. Untersuchungen an unstimulierten und mit steigender Intensität stimulierten Wildtyp-Zellen ergaben, dass viele Reninspeichervesikel keine klassisch runde Form aufweisen, sondern miteinander in Kontakt stehen und so ein sogenanntes Speichernetzwerk bilden. Die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration mittels Isoproterenol oder Erniedrigung der extrazellulären Calcium-Konzentration mittels EGTA führte zu einer Stimulation der Reninsekretionsrate und zu einer Erhöhung des Vernetzungsgrads der Reninspeichervesikel. Desweitern konnten bei hohen Stimulationsstufen Exozytoseereignisse beobachtet werden, deren Zahl jedoch bei noch höherer Stimulation konstant blieb, obwohl die Reninsekretionsrate weiter zunahm. Es ist anzunehmen, dass eine intrazelluläre Verschmelzung von Vesikelmembranen für einen erhöhten Ausstoß von aktivem Renin in den Intrazellulärraum verantwortlich ist. Ein derartiger Ausstoß von gepeichertem Material wird als Compound-Exozytose bezeichnet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden stimulierte und unstimulierte JG-Zellen von C57BL/6J-Lystbg-J/J-Mäusen untersucht. Der Phänotyp dieser Tiere ähnelt der Chediak-Higashi-Krankheit beim Menschen. Das bei diesem Genotyp ausgeknockte LYST- bzw. CHS1-Gen kodiert für das sogenannte lysosomal trafficking (LYST) Protein, welches auf bisher unbekannte Weise an der korrekten Ausbildung von lysosomalen Organellen beteiligt ist. Dementsprechend treten bei diesen, auch Beige-Mäuse genannten Tieren in mehreren Zellarten abnormal vergrößerte lysosomale Organellen und Granulen auf. Desweiteren weisen die JG-Zellen dieser Tiere eine abnormale Morphologie der Renin-speichervesikel auf. In der Tat waren sowohl in den für diese Arbeit angefertigten 3-dimensionalen Rekonstruktionen als auch auf TEM-Aufnahmen die Renin-speichervesikel der Beige-JG-Zellen deutlich vergrößert. Vier bis fünf sehr große, unregelmäßig geformte Reninspeichervesikel füllten fast das gesamte Zellvolumen der rekonstruierten Zellen aus. Unter Bedingungen, welche die Reninsekretionsrate stimulierten, konnten Exozytoseereignisse bei Beige-JG-Zellen beobachtet werden. Die Reninsekretionsrate der Beige-Mausnieren unterschied sich bei gleichen Stimulations-bedingungen nicht signifikant von der von Wildtyp-Mausnieren. Es ist anzunehmen, dass eine Fusion von Vesikel- und Zellmembran bei JG-Zellen im Allgemeinen nicht auf kleine Reninspeichervesikel beschränkt ist, sondern auch bei sehr großen kavernenartigen Vesikeln, wie sie in der Beige-Zelle auftreten, stattfindet. Im dritten Teil der vorliegenden Dissertation wurden unstimulierte JG-Zellen von Ren-1d-Cre/Cre-Mäusen 3-dimensional rekonstruiert. Diese Mäuse produzieren kein funktionelles Ren-1-Protein mehr. Es wird schon lange vermutet, dass nur das Ren-1-Protein in sekretorischen Vesikeln gespeichert und durch regulierte Exozytose sezerniert wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen diesen Befund. Die in den erstellten 3-dimensionalen Rekonstruktionen sichtbaren Vesikel waren gegenüber Reninspeichervesikeln des Wildtyps deutlich verkleinert und erschienen auf TEM-Aufnahmen weniger elektronendicht als diese. Es hat den Anschein, dass die in den Ren-1d-Cre/Cre-Zellen gefundenen Strukturen eher die prinzipielle Fähigkeit der Reninzellen wiederspiegeln, Speichervesikel zu bilden, und dass in ihnen kein funktionelles Renin-Protein gespeichert wird. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, SNARE-Proteine und Proteine, die mit ihnen interagieren, auf immunhistochemischem Weg mittels Fluoreszenzfärbung nachzuweisen. Zu diesem Zweck wurden 5μm dicke Paraffin- oder Cryoschnitte von Nierengewebe angefertigt, an denen die JG-Zellen gefärbt wurden. Als Vergleichsgewebe und Positivkontrolle diente Gewebe von typischen (Pankreas, Nebenniere) und atypischen (Schilddrüse, Nebenschilddrüse) endo- und exokrinen Drüsen. In dieser Arbeit konnten auf immunhistochemischem Weg keine der von uns untersuchten Proteine nachgewiesen werden. Entweder ist keines der in dieser Arbeit untersuchten Proteine am Exozytosemechanismus der JG-Zellen beteiligt, oder diese Proteine liegen in den JG-Zellen in sehr geringer, nicht mit Hilfe von Antikörpern nachweisbarer Konzentration vor

Lack of connexin 40 decreases the calcium sensitivity of renin-secreting juxtaglomerular cells

The so-called calcium paradoxon of renin describes the phenomenon that exocytosis of renin from juxtaglomerular cells of the kidney is stimulated by lowering of the extracellular calcium concentration. The yet poorly understood effect of extracellular calcium on renin secretion appears to depend on the function of the gap junction protein connexin 40 (Cx40) in renin-producing cells. This study aimed to elucidate the role of Cx40 for the calcium dependency of renin secretion in more detail by investigating if Cx40 function is really essential for the influence of extracellular calcium on renin secretion, if and how Cx40 affects intracellular calcium dynamics in renin-secreting cells and if Cx40-mediated gap junctional coupling of renin-secreting cells with the mesangial cell area is relevant for the influence of extracellular calcium on renin secretion. Renin secretion was studied in isolated perfused mouse kidneys. Calcium measurements were performed in renin-producing cells of microdissected glomeruli. The ultrastructure of renin-secreting cells was examined by electron microscopy. We found that Cx40 was not essential for stimulation of renin secretion by lowering of the extracellular calcium concentration. Instead, Cx40 increased the sensitivity of renin secretion response towards lowering of the extracellular calcium concentration. In line, the sensitivity and dynamics of intracellular calcium in response to lowering of extracellular calcium were dampened when renin-secreting cells lacked Cx40. Disruption of gap junctional coupling of renin-secreting cells by selective deletion of Cx40 from mesangial cells, however, did not change the stimulation of renin secretion by lowering of the extracellular calcium concentration. Deletion of Cx40 from renin cells but not from mesangial cells was associated with a shift of renin expression from perivascular cells of afferent arterioles to extraglomerular mesangial cells. Our findings suggest that Cx40 is not directly involved in the regulation of renin secretion by extracellular calcium. Instead, it appears that in renin-secreting cells of the kidney lacking Cx40, intracellular calcium dynamics and therefore also renin secretion are desensitized towards changes of extracellular calcium. Whether the dampened calcium response of renin-secreting cells lacking Cx40 function results from a direct involvement of Cx40 in intracellular calcium regulation or from the cell type shift of renin expression from perivascular to mesangial cells remains to be clarified. In any case, Cx40-mediated gap junctional coupling between renin and mesangial cells is not relevant for the calcium paradoxon of renin secretion

Activation of Hypoxia Signaling in Stromal Progenitors Impairs Kidney Development

Intrauterine hypoxia is a reason for impaired kidney development. The cellular and molecular pathways along which hypoxia exerts effects on nephrogenesis are not well understood. They are likely triggered by hypoxia-inducible transcription factors (HIFs), and their effects appear to be dependent on the cell compartment contributing to kidney formation. In this study, we investigated the effects of HIF activation in the developing renal stroma, which also essentially modulates nephron development from the metanephric mesenchyme. HIF activation was achieved by conditional deletion of the von Hippel Lindau tumor suppressor (VHL) protein in the forkhead box FOXD1 cell Lineage, from which stromal progenitors arise. The resulting kidneys showed maturation defects associated with early postnatal death. In particular, nephron formation, tubular maturation, and the differentiation of smooth muscle, renin, and mesangial cells were impaired. Erythropoietin expression was strongly enhanced. CodeLetion of VHL together with HIF2A but not with HIF1A Led to apparently normal kidneys, and the animals reached normal age but were anemic because of low erythropoietin levels. Stromal deletion of HIF2A or HIF1A alone did not affect kidney development. These findings emphasize the relevance of sufficient intrauterine oxygenation for normal renal stroma differentiation, suggesting that chronic activity of HIF2 in stromal progenitors impairs kidney development. Finally, these data confirm the concept that normal stroma function is essential for normal tubular differentiation

Renal Interstitial Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β Cells Support Proximal Tubular Regeneration

Background The kidney is considered to be a structurally stable organ with limited baseline cellular turnover. Nevertheless, single cells must be constantly replaced to conserve the functional integrity of the organ. PDGF chain B (PDGF-BB) signaling through fibroblast PDGF receptor-beta (PDGFR beta) contributes to interstitial-epithelial cell communication and facilitates regenerative functions in several organs. However, the potential role of interstitial cells in renal tubular regeneration has not been examined. Methods In mice with fluorescent protein expression in renal tubular cells and PDGFR beta-positive interstitial cells, weablated single tubular cells by high laser exposure. We then used serial intravital multiphoton microscopy with subsequent three-dimensional reconstruction and ex vivo histology to evaluate the cellular and molecular processes involved in tubular regeneration. Results Single-tubular cell ablation caused the migration and division of dedifferentiated tubular epithelial cells that preceded tubular regeneration. Moreover, tubular cell ablation caused immediate calcium responses in adjacent PDGFR beta-positive interstitial cells and the rapid migration thereof toward the injury. These PDGFR beta-positive cells enclosed the injured epithelium before the onset of tubular cell dedifferentiation, and the later withdrawal of these PDGFR beta-positive cells correlated with signs of tubular cell redifferentiation. Intraperitoneal administration of trapidil to block PDGFR beta impeded PDGFR beta-positive cell migration to the tubular injury site and compromised the recovery of tubular function. Conclusions Ablated tubular cells are exclusively replaced by resident tubular cell proliferation in a process dependent on PDGFR beta-mediated communication between the renal interstitium and the tubular system

Angiotensin II Short-Loop Feedback

The activity of the renin a Ootensin aldosterone system is triggered by the release of the protease renin from the kidneys, which in turn is controlled in the sense of negative feedback loops, It is widely assumed that Ang II (angiotensin II) directly inhibits renin expression and secretion via a short-loop feedback by an effect on renin-producing cells (RPCs) mediated by AT(1) (Aug II type 1) receptors. Because the concept of such a direct short-loop negative feedback control, which originates mostly from in vitro experiments, has not yet been systematically proven in vivo, we aimed to test the validity of this concept by studying the regulation of renin synthesis and secretion in mice lacking Aug II-AT(1) receptors on RPCs. We found that RPCs of the kidney express Ang II-AT(1) receptors. Mice with conditional deletion of Ang II-AT, receptors in RPCs were normal with regard to the number of renin cells, renal renin mRNA, and plasma renin concentrations. Renin expression and secretion of these mice responded to Ang I (angiotensin I) converting enzyme inhibition and to Ang II infusion like in wild-type (WT) controls. In summary, we did not obtain evidence that Ang II-AT(1) receptors on RPCs arc of major relevance for the normal regulation of renin expression and secretion in mice. Therefore, we doubt the existence of a direct negative feedback function of Ang II on RPCs