In vitro and in vivo studies of proatherogenic effects induced by end-products of cholesteryl esters oxidation

ABSTRACT:Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease and the major worldwide cause of human death. It is initiated by the constitutive uptake of modified low density lipoproteins trapped in the arterial intima by monocyte-derived macrophages, leading to the formation of foam cells. The oxidation levels and the quantity of lipid loading in macrophages influence their inflammatory phenotype and function. With time, atherosclerotic macrophages become dysfunctional and a clear trigger for this process relies on lysosomal malfunction. Eventually this process leads to apoptotic cells and toxic lipid accumulation in arterial intima, culminating in the formation of an irreversible advanced atheroma. Thus, the establishment of a correlation between the composition of lipid species and the irreversibility/instability of atherosclerotic lesions can contribute to the development of powerful tools for the diagnosis and treatment of the cardiovascular disease burden. The main objective of this work was the study of cholesteryl hemiesters (ChE), an oxidized product of cholesteryl esters, as an atherogenic compound. Here, using the shotgun lipidomics technique, we showed that these lipids are increased in the plasma of cardiovascular disease patients. We subsequently evaluated the in vitro and in vivo atherogenic relevance of these oxidized lipids. Monocytes and macrophages exposed to ChE presented an unusual inflammatory profile, presenting both pro- and anti-inflammatory markers. ChE-loaded macrophages revealed endocytic trafficking delays and dysfunctional enlarged lysosomes. The sub cellular location of the observed enlarged stressed lysosomes was more peripheral than lysosomes from control macrophages. Furthermore, these lysosomes from ChE-loaded macrophages displayed an increase in their exocytic capacity. In addition, macrophages stimulated with ChE revealed a metabolic shift, which, as with the inflammatory response, was dependent on toll-like receptor 4 signaling. These foamy macrophages also presented an increased proliferative capacity as compared to the control macrophages. Finally, using zebrafish larvae, several of the in vitro atherogenic properties of ChE were confirmed in vivo, namely lipid accumulation, inflammation and macrophage lysosomal dysfunction. Altogether, the work presented here contributes to the identification of new etiologic compounds in human atherosclerotic lesions and advances our mechanistic understanding of the alterations observed in atherosclerotic macrophages.RESUMO: A aterosclerose é uma doença inflamatória crónica e a principal causa de morte no mundo inteiro. Caracteriza-se pela internalização contínua de lipoproteínas de baixa densidade, que sofreram modificações por macrófagos derivados de monócitos, levando à formação de “células espumosas”. O nível de oxidação lipídica e a quantidade de lípido internalizada pelos macrófagos influencia o seu fenótipo e a sua função inflamatória. Com o tempo, os macrófagos presentes na lesão tornam-se disfuncionais e um dos principais responsáveis por este processo é o mau funcionamento dos lisossomas. Eventualmente, esta disfunção lisossomal leva à formação de células apoptóticas e à acumulação de lípidos tóxicos na íntima arterial, culminando na formação de um ateroma de estado avançado e irreversível. Deste modo, o estabelecimento de uma correlação entre a composição das espécies lipídicas e a irreversibilidade/instabilidade da lesão pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas fundamentais no diagnóstico e tratamento de doenças cardiovasculares. O objetivo principal deste trabalho foi o estudo de hemiesteres de colesterol (ChE), produtos resultantes da oxidação de ésteres de colesterol, como compostos aterogénicos. Neste trabalho, através da utilização da técnica de lipidómica “shotgun”, demonstramos que os ChE estão aumentados no plasma de pacientes com doenças cardiovasculares. De seguida, avaliamos a relevância aterogénica destes lípidos oxidados, através de estudos in vitro e in vivo. Monócitos e macrófagos expostos a ChE apresentaram um perfil inflamatório incomum, exibindo marcadores pró- e anti-inflamatórios. Os macrófagos carregados de ChE revelaram atrasos no tráfego endocítico e um aumento do tamanho dos seus lisossomas, assim como uma perda da sua função. Observou-se, também, uma alteração da localização dos lisossomas stressados nas células tratadas com ChE, verificando-se uma distribuição mais periférica, enquanto as células controlo apresentam uma distribuição mais homogénea dos lisossomas. Estes lisossomas de macrófagos carregados com ChE demonstraram um aumento adicional da sua capacidade exocítica. Além disso, os macrófagos estimulados com ChE revelaram uma alteração metabólica, que juntamente com a resposta inflamatória, foi dependente da sinalização através do receptor “toll like receptor-4”. Os macrófagos “espumosos” apresentaram, ainda, um aumento da capacidade proliferativa em relação aos macrófagos controlo. Finalmente, usando larvas de peixe-zebra, várias propriedades aterogénicas dos ChE observadas in vitro foram confirmadas in vivo, nomeadamente, a acumulação de lípidos, a propriedade inflamatória e a disfunção lisossomal em macrófagos. Em suma, o trabalho aqui apresentado contribui para a identificação de novos compostos etiológicos nas lesões de aterosclerose humana e contribui para o avanço da nossa compreensão mecanística das alterações celulares nos macrófagos das lesões

Elementos de integração didática e ensino da leitura : fundamentos e importância didática

Relatório de Estágio apresentado à Escola Superior de Educação do Instituto Politécnico de Castelo Branco para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Educação Pré- Escolar e Ensino do 1º Ciclo do Ensino Básico.A elaboração de um relatório de estágio que reúna a Prática Supervisionada com a realização de uma investigação em educação é um dos requisitos indispensáveis para a obtenção do grau de mestre em Educação Pré-Escolar e Ensino do 1º Ciclo do Ensino Básico. Partindo do problema Elementos de Integração Didática e Ensino da Leitura: Fundamentos e Importância Didática, procurou-se analisar a importância do elemento integrador, enquanto elemento técnico-didático para o desenvolvimento dos processos de decifração e compreensão da leitura nos primeiros anos de escolaridade (1º Ciclo do Ensino Básico). Como refere Carlos Drummond de Andrade, “A leitura é uma fonte inesgotável de prazer mas por incrível que pareça, a quase totalidade, não sente esta sede” E é por essa razão que, neste trabalho, se procuram encontrar formas de motivar os alunos a ler, nomeadamente, através da utilização de recursos, como os elementos integradores e os guiões de aprendizagem, que permitam criar uma efetiva integração didática e uma correta iniciação literária. Ao longo deste relatório de estágio constatou-se, ainda, que desta forma é possível trabalhar os momentos antes, durante e depois da leitura e a forma como estes contribuem para a decifração e compreensão da leitura. Em suma: este trabalho permitiu-nos crescer ao nível pessoal e profissional, bem como perceber melhor os alunos e constatar que uma boa prática pedagógica pode despertar nos alunos o gosto pela leitura.The formulation of a probation report which includes Supervised Practice with an investigation in education is one of the indispensable requirements for the Preschool Education and 1st Cycle:Master’s Degree. Starting with the problem Elements of Integration Teaching and Reading Tutorship: Foundations and Didactic Importance we tried to analyze the value of integrator element, while technical-didactic element to the development of the transferal process and reading comprehension on the schooling first years. As regards Carlos Drummond de Andrade2 “Reading is an inexhaustible pleasure source but Incredibly nearly all don’t feel that thirst”. And so, it is for this reason that, in this study, we try to find ways to motivate students to read, in particular, through the use of resources, like the integrative elements and script of learning, which allows create an effective didactic integration and a correct introduction to literary education. Throughout this probation report, it was also noted that, by this method is possible to work out the moments before, during and after reading and how they contribute for reading transferal process and comprehension. In short: this study allowed us to grow up to a personal and professional level, as well as better understand students and how a good pedagogical practice can awake them the taste for reading

Hemoglobina a1c, frutosamina e albumina glicada na diabetes gestacional: marcadores de controlo metabólico e desfechos materno-fetais

RESUMO:Na DG, existe uma associação contínua entre a hiperglicémia materna e os resultados perinatais adversos (Metzger et al., 2008). A minimização dos mesmos implica a otimização do controlo metabólico (Hartling et al. 2013). Na prática clínica atual, isto passa pela aferição das intervenções, como a modificação do estilo de vida ou a terapêutica farmacológica, ao perfil de glicémias capilares diário auto-determinado, de forma a atingir os alvos recomendados (Langer et al., 1989, 1991; De Veciana et al., 1995). A vigilância baseada nas glicémias capilares permite um controlo estrito. Facilita também a compreensão da relação com as refeições, eventos e atividade física. No entanto, reflete apenas a glicémia instantânea, que é susceptível a fatores como as emoções ou a dieta. Não é informativa no que diz respeito a valores crónicos ou médios. Além disso, a dor e inconveniência associadas às múltiplas punções capilares diárias resultam frequentemente numa má adesão. Os indicadores de glicémia podem auferir informação distinta, adicional. O marcador tradicional na Diabetes Mellitus (DM) é a hemoglobina glicada (HbA1c). O seu lugar na abordagem das mulheres grávidas com DM tipo 1 e tipo 2 já está estabelecido (Endocrine Society - ES, 2013; Organização Mundial de Saúde - OMS, 2013a; International Federation of Gynecology and Obstetrics - FIGO, 2015; Sociedade Portuguesa de Diabetologia- SPD, 2016; American College of Obstetrics and Gynecology - ACOG, 2018; American Diabetes Association - ADA, 2018; National Institute of Care and Excellence - NICE 2018). A sua utilidade clínica na DG, porém, é controversa. Além das limitações conhecidas e transversais (como é o caso da interpretação em situações de hemoglobinopatias ou de semi-vida alterada dos eritrócitos), tem particularidades que podem constituir uma restrição à sua utilização na gravidez. Por exemplo, traduz a concentração média de glicémia de um período de tempo longo (um a quatro meses), se atendermos a que a gravidez se trata de um estado dinâmico com uma resistência periférica à ação da insulina rapidamente progressiva. É também afetada pelos estados de ferropénia, tão frequentes na gestação. Existem outros biomarcadores, não tradicionais, que têm características que os tornam alternativas interessantes como indicadores de glicémia na DG. A albumina glicada é informativa da glicémia média nas duas a três semanas anteriores à sua determinação. Não é influenciada pela anemia da hemodiluição ou pelos estados de carência de ferro. A sua aplicação atual limita-se às situações em que se sabe que o valor da HbA1c não é fidedigno. É superior ao marcador tradicional a prever complicações cardiovasculares, internamentos e morte na população diabética sob hemodiálise. Não tem intervalos de referência amplamente reconhecidos na gravidez. A frutosamina reflete a concentração média da glicose nas duas a quatro semanas que a antecedem. Não se altera consoante as características da hemoglobina e tem uma determinação analítica tecnicamente simples, rápida, precisa e barata. À semelhança da albumina glicada, atualmente utiliza-se apenas nas populações em se sabe que a HbA1c não é um bom biomarcador. Já mostrou associação a complicações microvasculares, macrovasculares e mortalidade em diabéticos com insuficiência renal crónica sujeitos a hemodiálise. Há pouca evidência disponível da sua utilidade na gravidez. O principal objetivo desta investigação foi esclarecer se, na DG, existe uma associação entre a HbA1c, a albumina glicada e a frutosamina das grávidas e desfechos perinatais negativos. Para isso, acompanhámos uma coorte de 100 mulheres com gravidez unifetal e DG e sua descendência até à oitava semana de puerpério. Num primeiro estudo (n=82 grávidas), analisámos a importância destes marcadores determinados no mês que antecedeu o parto, na variabilidade do peso dos recém-nascidos e se, individualmente ou em conjunto, foram preditores do status de grandes para a idade gestacional. No segundo estudo (n=85 grávidas) explorámos se existe relação com as seguintes complicações neonatais: disfunção respiratória, hipoglicémia, hipocalcémia, policitémia, hiperbilirrubinémia, miocardiopatia hipertrófica e internamentos na Unidade de Cuidados Intensivos Neonatais. Em modelos de regressão linear, concluímos que todos os biomarcadores estudados se associaram ao peso dos recém-nascidos. Para cada unidade adicional de albumina glicada, 20 unidades de frutosamina, ou unidade de HbA1c, existiu um aumento médio do peso dos recémnascidos de 76,08 g (p<0,001), de 69,66 g (p<0,001), e de 456,53 (p<0,001), respetivamente. Os modelos desenvolvidos que incluíram a frutosamina e a albumina glicada tiveram um desempenho semelhante (R2 =0,62 e R2 =0,61, respetivamente), e superior ao da HbA1c (R2 =0,58). Estudámos posteriormente se existia um valor aditivo dos biomarcadores alternativos em relação à HbA1c, visto que este último é o indicador tradicional. Efetivamente, os melhores modelos foram aqueles em que se adicionava a albumina glicada ou a frutosamina ao modelo de base com as variáveis clínicas e a HbA1c (R2 =0,67 para o modelo clínico com HbA1c e albumina glicada e R2 =0,66 para o modelo clínico com HbA1c e frutosamina). Em modelos de regressão logística, todos os biomarcadores se associaram a recém-nascidos grandes para a idade gestacional. Para cada unidade adicional de albumina glicada, acréscimo de 20 unidades de frutosamina ou de uma unidade de HbA1c existiu um aumento na possibilidade de ter um recém-nascido grande para a idade gestacional de 61% (p<0,001), de 45% (p<0,001) ou quatro vezes superior (p=0,032), respetivamente. O modelo com melhor capacidade discriminativa para identificar recém-nascidos grandes para a idade gestacional foi aquele que incluiu a albumina glicada (AUC 0,81), seguido pelo da frutosamina (AUC 0,79) e só depois pelo da HbA1c (AUC 0,71). Apenas a albumina glicada e a frutosamina foram preditivas do nascimento de recémnascidos com disfunção respiratória. Por cada aumento de uma unidade de albumina glicada e de 20 unidades de frutosamina existiu um aumento da possibilidade de 41% (p=0,004) e de 26% (p=0,014) de ter um recém-nascido com disfunção respiratória. A capacidade discriminativa da albumina glicada para este desfecho foi superior à da frutosamina (AUC 0,83 e 0,81, respetivamente) e ambas foram superiores à da HbA1c (AUC 0,76). Ao contrário do que sucedeu com a HbA1c, a albumina glicada e a frutosamina associaram- -se ao nascimento de um filho com pelo menos uma complicação neonatal. Por cada unidade adicional de albumina glicada e por cada acréscimo de 20 unidades de frutosamina, existiu um aumento de 33% (p=0,015) e de 24% (p=0,027), respetivamente, na possibilidade de ter um recém-nascido com pelo menos uma complicação. O modelo com albumina glicada foi o que obteve AUC mais elevada, seguido pelo da frutosamina e depois pelo da HbA1c (AUC de 0,82; 0,81 e 0,79; respetivamente). Na nossa coorte, os biomarcadores estudados não foram significativamente diferentes entre as mulheres com recém-nascidos com e sem hipoglicémia, hipocalcémia, policitémia e hiperbilirrubinémia neonatais, miocardiopatia hipertrófica ou que necessitaram de internamento na Unidade de Cuidados Intensivos. Concluímos que a albumina glicada e a frutosamina parecem ser superiores à HbA1c como marcadores de algumas complicações perinatais nos filhos de mulheres com DG. Os nossos estudos foram unicêntricos e de pequenas dimensões. Além disso, não foram contempladas medidas adicionais de crescimento fetal e de adiposidade, que podem relacionar-se melhor com os biomarcadores do que apenas o peso dos recém-nascidos. Não foi ainda recolhida informação relativa ao perfil lipídico das mulheres, que pode também influenciar o peso dos recém- -nascidos. São necessários mais estudos de maior dimensão para comprovar os nossos achados. A confirmarem-se, tanto a albumina glicada como a frutosamina podem vir a ser ferramentas clínicas importantes na abordagem da DG.ABSTRACT: In Gestational Diabetes (GD) there is an association between maternal hyperglycemia and adverse perinatal outcomes (Metzger et al., 2008). Minimizing negative results implies optimizing metabolic control (Hartling et al., 2013). In current clinical practice, this means adjusting interventions, such as lifestyle modifications or pharmacological therapy, to self-determined daily capillary glycemia profile, in order to reach the recommended targets (Langer et al., 1989, 1991; De Veciana et al., 1995). Vigilance based on capillary glycemia allows strict metabolic control. It also facilitates the understanding of the relationship with meals, events and physical activity. However, it reflects only the instantaneous glycemia, which is susceptible to factors such as emotions or diet. It is not informative with regard to chronic or average values. In addition, the pain and inconvenience associated with multiple daily capillary punctures often result in poor adherence. The glycemic indicators can provide different, additional information. The traditional marker in DM is HbA1c. Its place in approaching pregnant women with type 1 and type 2 DM is already established (Endocrine Society - ES, 2013; World Health Organization, 2013a; International Federation of Gynecology and Obstetrics - FIGO, 2015; Sociedade Portuguesa de Diabetologia - SPD, 2016; American College of Obstetrics and Gynecology - ACOG, 2018; American Diabetes Association - ADA, 2018; National Institute of Care and Excellence - NICE 2018). Its clinical utility in GD, however, is controversial. In addition to its known and transverse limitations (such as interpretation in hemoglobinopathies or altered half-lives of erythrocytes), there are particularities that may constitute a limitation to its use in pregnancy. For instance, it refletcs the average concentration of glycemia over a long period of time (one to four months) if we consider that pregnancy is a dynamic state with a rapidly progressive peripheral resistance to insulin action. It is also affected by the iron deficiency states, so frequent in pregnancy. There are other, non-traditional biomarkers, with characteristics that make them interesting alternatives as glycemic indicators in GD. Glycated albumin is informative for average glycemia within two to three weeks prior to its determination. It is not influenced by hemodilution anemia or iron deficiency states. Its current application is limited to situations in which the value of HbA1c is known to be unreliable. It is superior to the traditional marker in predicting cardiovascular complications, hospitalizations and death in the diabetic population under hemodialysis. There are no widely recognized reference ranges for pregnancy. Fructosamine reflects the average concentration of glucose in the two to four weeks preceding it. It does not change according to the characteristics of hemoglobin and has a technically simple, rapid, accurate and inexpensive analytical determination. As for glycated albumin, its clinical use is limited to populations where it is known that HbA1c is not a good biomarker. It has been shown 18 to be associated with microvascular, macrovascular complications and mortality in diabetics with chronic renal failure undergoing hemodialysis. There is little evidence of its usefulness in pregnancy. The main objective of this investigation was to clarify whether, in GD, there is an association between HbA1c, glycated albumin and fructose of pregnant women and negative perinatal outcomes. For this, we followed a cohort of 100 women with unifetal pregnancy and Gestational Diabetes and their offspring up to the eighth week of puerperium. After exclusion criteria were applied, we analyzed the importance of these markers determined in the month before delivery, in the weight variability of the newborns and whether, individually or in combination, they can help predict the birth of newborns large for gestational age. We also investigated whether there is a relationship with the following neonatal complications: respiratory dysfunction, hypoglycaemia, hypocalcaemia, polycythemia, hyperbilirubinemia, hypertrophic cardiomyopathy and hospitalizations in the Neonatal Intensive Care Unit. We concluded that all biomarkers under study were associated with newborn weight. For each additional unit of glycated albumin, 20 units of fructosamine, or one unit increase of HbA1c, there was a mean increase in newborn weight of 76.08 g (p<0.001), 69.66 g (p<0.001), and 456.53 g (p<0.001), respectively. The models developed that included fructosamine and glycated albumin performed similarly (R2 =0.62 and R2 =0.61, respectively), and better than that of HbA1c (R2 =0.58). We further studied whether there was an added value of the alternative biomarkers in relation to HbA1c, since the latter is the traditional indicator. In fact, the best models were those in which glycated albumin or fructosamine were added to the base model with the clinical variables and HbA1c (R2 =0.67 for the clinical model with HbA1c and glycated albumin and R2 =0.66 for the clinical model with HbA1c and fructosamine). All biomarkers were associated with the birth of newborns large for gestational age. For each additional unit of glycated albumin, an increase of 20 units of fructosamine or one unit increase of HbA1c, there was an increase in the odds of having a newborn large for gestational age of 61% (p<0.001), of 45% (p<0.001) or four times higher (p=0.032), respectively. The model with the best discriminative ability to identify newborns large for gestational age was the one that included glycated albumin (AUC 0,81), followed by that of fructosamine (AUC 0,79) and only after that of HbA1c (AUC 0,71). Only glycated albumin and fructosamine were associated with the birth of newborns with respiratory dysfunction. For each increase of one unit of glycated albumin and 20 units of fructosamine there was an increased odd of 41% (p=0.004) and 26% (p=0.014) of having a newborn with respiratory problems. The discriminative ability of glycated albumin for this outcome was higher than that of fructosamine (AUC 0.83 and 0.81, respectively) and both were superior to that of HbA1c (AUC 0.76). In contrast to HbA1c, glycated albumin and fructosamine were associated with the birth of a child with at least one complication. For each additional unit of glycated albumin and for each increment of 20 units of fructosamine, there was an increase of 33% (p=0.015) and 24% (p=0.027), respectively, in the odds of having a newborn with at least one neonatal complication. The model with glycated albumin was the one that obtained the highest AUC, followed by that of fructosamine and then by HbA1c (AUC of 0.82, 0.81 and 0.79, respectively). In our cohort, the studied biomarkers were not significantly different among women with neonates with and without hypoglycaemia, hypocalcaemia, neonatal polycythaemia and hyperbilirubinemia, hypertrophic cardiomyopathy or hospitalization in the Intensive Care Unit. We concluded that glycated albumin and fructosamine appear to be superior to HbA1c as markers of perinatal complications in the offspring of women with GD. We do not know if the information given by these alternative glycemic indicators is additional to that of HbA1c. Our studies were unicentric and with small sample size. In addition, no additional measures of fetal growth and adiposity have been contemplated, which may relate better to biomarkers than just newborn weight. Information on the lipid profile of women, which may also influence the weight of newborns, was not collected as well. More and larger studies are needed to prove our findings. Both glycated albumin and fructosamine may prove to be important clinical tools in GD management

Unveiling the interaction of vanadium compounds with human serum albumin by using 1H STD NMR and computational docking studies

The binding of the VV oxidation products of two vanadium(IV) compounds, [VO(dmpp)2] and [VO(maltolato)2], which have shown promising anti-diabetic properties, to human serum albumin (HSA) in aqueous aerobic solution has been studied by 1H saturation transfer difference (STD) NMR spectroscopy and computational docking studies. Group epitope mapping and docking simulations indicate a preference of HSA binding to the 1:1 [VO2(dmpp)(OH)(H2O)]- and 1:2 [VO 2(maltol)2]- vanadium(V) species. By using known HSA binders, competition NMR experiments revealed that both complexes preferentially bind to drug site I. Docking simulations carried out with HADDOCK together with restraints derived from the STD results led to three-dimensional models that are in agreement with the NMR spectroscopic data, providing useful information on molecular interaction modes. These results indicate that the combination of STD NMR and data-driven docking is a good tool for elucidating the interactions in protein-vanadium compounds and thus for clarifying the mechanism of drug delivery as vanadium compounds have shown potential therapeutic properties. 1H STD NMR analysis complemented by HADDOCK studies have revealed that the [VO2(dmpp)(H2O)(OH)] - species, resulting from the oxidation of the potential insulin mimetic VO(dmpp)2, binds preferentially to HSA site I. These findings corroborate the involvement of this serum protein in the transport of vanadium species in the blood stream and their delivery to target cells

Cholesteryl hemiesters alter lysosome structure and function and induce proinflammatory cytokine production in macrophages

Rationale: Cholesteryl hemiesters are oxidation products of polyunsaturated fatty acid esters of cholesterol. Their oxo-ester precursors have been identified as important components of the "core aldehydes" of human atheromata and in oxidized lipoproteins (Ox-LDL). We had previously shown, for the first time, that a single compound of this family, cholesteryl hemisuccinate (ChS), is sufficient to cause irreversible lysosomal lipid accumulation (lipidosis), and is toxic to macrophages. These features, coupled to others such as inflammation, are typically seen in atherosclerosis. Objective: To obtain insights into the mechanism of cholesteryl hemiester-induced pathological changes in lysosome function and induction of inflammation in vitro and assess their impact in vivo. Methods and results: We have examined the effects of ChS on macrophages (murine cell lines and primary cultures) in detail. Specifically, lysosomal morphology, pH, and proteolytic capacity were examined. Exposure of macrophages to sub-toxic ChS concentrations caused enlargement of the lysosomes, changes in their luminal pH, and accumulation of cargo in them. In primary mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM), ChS-exposure increased the secretion of IL-1 beta, TNF-alpha and IL-6. In zebrafish larvae (wild-type All and PU.1:EGFP), fed with a ChS-enriched diet we observed lipid accumulation, myeloid cell-infiltration in their vasculature and decrease in larval survival. Under the same conditions the effects of ChS were more profound than the effects of free cholesterol (FC). Conclusions: Our data strongly suggest that cholesteryl hemiesters are pro-atherogenic lipids able to mimic features of Ox-LDL both in vitro and in vivo.NOVA4Health - UID/Multi/04462/2013, a program financially supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)/Ministério da Educação e Ciência, through national funds and co-funded by FEDER under the PT2020 Partnership Agreement. FCT fellowship references: SFRH/BPD/26843/2006, SFRH/BD/62126/2009, SFRH/BD/90258/2012, SFRH/BD/84685/2012, SFRH/BPD/102229/2014, SFRH/BD/52293/2013info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Connexin43 promotes exocytosis of damaged lysosomes through actin remodelling

A robust and efficient cellular response to lysosomal membrane damage prevents leakage from the lysosome lumen into the cytoplasm. This response is understood to happen through either lysosomal membrane repair or lysophagy. Here we report exocytosis as a third response mechanism to lysosomal damage, which is further potentiated when membrane repair or lysosomal degradation mechanisms are impaired. We show that Connexin43 (Cx43), a protein canonically associated with gap junctions, is recruited from the plasma membrane to damaged lysosomes, promoting their secretion and accelerating cell recovery. The effects of Cx43 on lysosome exocytosis are mediated by a reorganization of the actin cytoskeleton that increases plasma membrane fluidity and decreases cell stiffness. Furthermore, we demonstrate that Cx43 interacts with the actin nucleator Arp2, the activity of which was shown to be necessary for Cx43-mediated actin rearrangement and lysosomal exocytosis following damage. These results define a novel mechanism of lysosomal quality control whereby Cx43-mediated actin remodelling potentiates the secretion of damaged lysosomes

Oxidized cholesteryl ester induces exocytosis of dysfunctional lysosomes in lipidotic macrophages

Funding Information: This work was financially supported by FCT (Foundation for Science and Technology of the Portuguese Ministry of Science and Higher Education) through national funds and co‐funded by FEDER under the PT2020 Partnership (Ref. PTDC/MED‐PAT/29395/2017, 2022.01305.PTDC and 2022.03249.PTDC). The Coimbra Chemistry Center (CQC) is supported by the FCT through Project UID/QUI/00313/2019. MSCA‐RISE: “Genetic and Small Molecule Modifiers of Lysosomal Function” (LysoMod), financed by Horizon 2020. Ref 734825. Twinning on “Excel in Rare Diseases' Research: Focus on LYSOsomal Disorders and CILiopathies”, Ref (H2020‐TWINN‐2017: GA 81108). Neuza Domingues was a holder of PhD fellowship from the FCT (Ref. No: SFRH/BD/51877/2012), attributed by Inter‐University Doctoral Programme in Ageing and Chronic Disease (PhDOC). André R.A. Marques was funded by the FCT Stimulus of Scientific Employment Individual Support Call 2017 (CEECIND/01006/2017). Rosa Puertollano was funded by the NHLBI Division of Intramural Research (ZIA HL006151‐10). Publisher Copyright: © 2023 John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd.A key event in atherogenesis is the formation of lipid-loaded macrophages, lipidotic cells, which exhibit irreversible accumulation of undigested modified low-density lipoproteins (LDL) in lysosomes. This event culminates in the loss of cell homeostasis, inflammation, and cell death. Nevertheless, the exact chemical etiology of atherogenesis and the molecular and cellular mechanisms responsible for the impairment of lysosome function in plaque macrophages are still unknown. Here, we demonstrate that macrophages exposed to cholesteryl hemiazelate (ChA), one of the most prevalent products of LDL-derived cholesteryl ester oxidation, exhibit enlarged peripheral dysfunctional lysosomes full of undigested ChA and neutral lipids. Both lysosome area and accumulation of neutral lipids are partially irreversible. Interestingly, the dysfunctional peripheral lysosomes are more prone to fuse with the plasma membrane, secreting their undigested luminal content into the extracellular milieu with potential consequences for the pathology. We further demonstrate that this phenotype is mechanistically linked to the nuclear translocation of the MiT/TFE family of transcription factors. The induction of lysosome biogenesis by ChA appears to partially protect macrophages from lipid-induced cytotoxicity. In sum, our data show that ChA is involved in the etiology of lysosome dysfunction and promotes the exocytosis of these organelles. This latter event is a new mechanism that may be important in the pathogenesis of atherosclerosis.publishersversionpublishe

Ex vivo and in vivo studies with VO (dmpp) : validation of its anti-diabetic properties

Dissertação de mestrado em Ecologia apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.The compound bis(1,2-dimethyl-3-hydroxy-4-pyridinone) oxovanadium(IV), VO(dmpp)2 has been extensively studied in our group. Structural studies were already carried out to characterize the vanadium species present in solution at physiological conditions and it was also determined pKa values and stability constants. Biochemical studies with cellular models have shown that this compound has properties indicative of insulin mimetism. In particular, ex vivo studies with rat adipocytes demonstrated that it increases glucose uptake, inhibits FFA release and promotes Akt phosphorylation, in non-toxic concentrations. More recently, in vivo studies with Zucker fatty rats, an obese pre-diabetic animal model, clearly showed that treatment with a daily dose of this compound during 30 days, ameliorates the diabetic features characteristic of this animal model such as gain of body weight, abdominal fat width and hepatic triglycerides content as assessed by MRI/MRS techniques. It was also demonstrated a totally reverses the glucose intolerant profile. In this work further studies were carried out to validate the promising anti-diabetic capacity of VO(dmpp)2, using ex vivo studies with isolated GK rat adipocytes and pancreatic islets, adipocytes from human adipose tissue and in vivo studies with GK rats, a type 2 diabetic model. Ex vivo parameters indicative of insulin mimetism were evaluated such as stimulated glucose uptake, inhibition of glycerol release and glucose induced insulin secretion in hypoglycaemic and hyperglycaemic states. Additionally, in vivo parameters observed were body weight, blood glucose levels and the oral glucose tolerant test. In glucose uptake studies, insulin was used as a positive control and, in experiences of adipocytes from rats, BMOV, a compound which was already in clinical trials, was also tested for comparison. Wistar rats were used as a normal control. The data obtained indicates that VO(dmpp)2, in non-toxic concentrations, promotes glucose uptake by GK rat and human adipocytes, similarly to physiological insulin concentrations, and has a better performance than BMOV in 6 the same concentration. This means that VO(dmpp)2 can act as a substitute of insulin although the results showed that it doesnʼt enhance insulin action. Preliminary results showed that this compound seems to inhibit glycerol release from human adipocytes, reinforcing previous published data about specific effects on lipid metabolism. It was also observed a increase of glucose-induced insulin secretion by β-cells in the presence of VO(dmpp)2 which is concentration –dependent. A daily dose of 44 μmol/Kg body weight of VO(dmpp)2, was intraperitoneal administered to GK and Wistar rats during 21 days. It was verified that the treatment had no much effect on the normal progression of body weight of Wistar and GK rats, however, decreased blood glucose levels in the type 2 diabetic model and ameliorates the glucose intolerant profile characteristic of these animals. The data here obtained corroborate previous published results with other cell and animal models, and provide additional positive information. Thus, it was reinforced the antidiabetic properties of VO(dmpp)2.O composto bis(1,2-dimetil-3-hidroxi-4-piridinona) oxovanadio(IV), VO(dmpp)2 tem sido extensivamente estudado no nosso grupo. Estudos estruturais foram já realizados com o objetivo de caracterizar as espécies de vanádio presentes em solução, em condições fisiológicas, assim como, determinar os valores de pKa e as constantes de estabilidade. Estudos bioquímicos com modelos celulares mostraram que este composto tem propriedades insulino-miméticas. Em particular, estudos ex vivo com adipocitos de ratos demonstraram um aumento na captação de glicose, inibição da libertação de FFA e aumento da fosforilação da Akt na presença de concentrações não toxicas. Recentemente, estudos in vivo com ratos obesos Zucker, um modelo animal diabético e obeso, demonstraram claramente que o tratamento com doses diárias deste composto durante 30 dias, reduz as características diabéticas típicas deste modelo animal como o ganho de peso, a gordura abdominal e os triglicerídeos hepáticos, monitorizados pela técnica de MRI/MRS. Foi também demonstrado uma total regressão do perfil de intolerância a glicose. Neste trabalho novos estudos foram realizados para validar a capacidade antidiabética do VO(dmpp)2, utilizando adipócitos e ilhéus pancreáticos isolados de ratos GK, adipócitos isolados de humanos e estudos in vivo com ratos GK, um modelo animal diabético tipo 2. Foram avaliados os parâmetros ex vivo indicativos de insulino mimetismo, tais como, captação de glicose, inibição da libertação de glicerol e a secreção de insulina estimulada por glucose num estado hipo e hiperglicémico. Adicionalmente, os parêmetros in vivo observados foram o peso do corpo, os níveis de glicose no sangue e o teste de tolerância à glicose. Nos estudos de captação de glicose, a insulina foi utilizada como controlo positivo e, nas experiências com adipócitos de ratos, o BMOV, um composto que já teve em testes clínicos, foi também testado para comparação. Os ratos Wistar foram utilizados como controlo normal. Os resultados obtidos indicam que o VO(dmpp)2, em concentrações não tóxicas, promove a captação de glucose in adipócitos de ratos GK e humanos, com valores semelhantes aos correspondentes às concentração de insulina em condições fisiológicas, e possui uma maior eficiência comparando com a mesma concentração de BMOV. Estes resultados significam que VO(dmpp)2 pode atuar como substituto da insulina, embora os resultados mostram que não aumenta o seu efeito. Resultados preliminares demonstraram que este composto parece inibir a libertação de gliceraol em adipócitos humanos, reforçando os resultados previamente publicados sobre o efeito especifico no metabolismo dos lípidos. Foi também demonstrado um aumento da secreção de insulina estimulada por glicose, em células-β do pâncreas, na presenção de VO(dmpp)2, demonstrando um efeito dependente da concentração. Uma dose diária de 44 μmol/Kg por peso de corpo de VO(dmpp)2 foi administrado i.p. a ratos Wistar (control) e GK durante 21 dias. Não foi verificado nenhum efeito na normal progressão de crescimentos de ambos os ratos, no entanto, foi verificado uma diminuição do nível de glicose no sangue dos ratos diabéticos e foi também verificado um melhoramento no perfil de intolerância a glicose característico destes animais. Os resultados apresentados aqui estão de acordo com os resultados publicados com outras células e outros modelos animais, e providenciam importante informação. Assim, foram reforçadas as propriedades anti-diabéticas do VO(dmpp)2

Connexin43 promotes exocytosis of damaged lysosomes through actin remodelling

Actin-remodelling; Connexin43; Lysosomal damageRemodelación de actina; Conexina43; Daño lisosomalRemodelació d'actina; Connexina43; Dany lisosomalA robust and efficient cellular response to lysosomal membrane damage prevents leakage from the lysosome lumen into the cytoplasm. This response is understood to happen through either lysosomal membrane repair or lysophagy. Here we report exocytosis as a third response mechanism to lysosomal damage, which is further potentiated when membrane repair or lysosomal degradation mechanisms are impaired. We show that Connexin43 (Cx43), a protein canonically associated with gap junctions, is recruited from the plasma membrane to damaged lysosomes, promoting their secretion and accelerating cell recovery. The effects of Cx43 on lysosome exocytosis are mediated by a reorganization of the actin cytoskeleton that increases plasma membrane fluidity and decreases cell stiffness. Furthermore, we demonstrate that Cx43 interacts with the actin nucleator Arp2, the activity of which was shown to be necessary for Cx43-mediated actin rearrangement and lysosomal exocytosis following damage. These results define a novel mechanism of lysosomal quality control whereby Cx43-mediated actin remodelling potentiates the secretion of damaged lysosomes.This work was supported by the European Regional Development Fund (ERDF) through the Operational Program for Competitiveness Factors (COMPETE) under the projects: PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122, UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, project FCT-PTDC/MED-NEU/8030/2020, FCT-2022.09311, ‘la Caixa’ Foundation/HR22-00854, John Black Charitable Foundation and Wellcome Trust Award in Science/224361/Z/21/Z, Horizon 2020 grant 857524, and the Comissão de Coordenação e Desenvolvimento Regional do Centro - CCDRC through the Centro2020 Programme. This work was partially supported by the H2020 Twinning project RESETageing (GA 952266)