ABSTRACT:Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease and the major worldwide cause of human
death. It is initiated by the constitutive uptake of modified low density lipoproteins trapped
in the arterial intima by monocyte-derived macrophages, leading to the formation of foam
cells. The oxidation levels and the quantity of lipid loading in macrophages influence their
inflammatory phenotype and function. With time, atherosclerotic macrophages become
dysfunctional and a clear trigger for this process relies on lysosomal malfunction. Eventually
this process leads to apoptotic cells and toxic lipid accumulation in arterial intima, culminating
in the formation of an irreversible advanced atheroma. Thus, the establishment of
a correlation between the composition of lipid species and the irreversibility/instability of
atherosclerotic lesions can contribute to the development of powerful tools for the diagnosis
and treatment of the cardiovascular disease burden. The main objective of this work was
the study of cholesteryl hemiesters (ChE), an oxidized product of cholesteryl esters, as an
atherogenic compound. Here, using the shotgun lipidomics technique, we showed that these
lipids are increased in the plasma of cardiovascular disease patients. We subsequently evaluated
the in vitro and in vivo atherogenic relevance of these oxidized lipids. Monocytes and
macrophages exposed to ChE presented an unusual inflammatory profile, presenting both
pro- and anti-inflammatory markers. ChE-loaded macrophages revealed endocytic trafficking
delays and dysfunctional enlarged lysosomes. The sub cellular location of the observed enlarged
stressed lysosomes was more peripheral than lysosomes from control macrophages.
Furthermore, these lysosomes from ChE-loaded macrophages displayed an increase in their
exocytic capacity. In addition, macrophages stimulated with ChE revealed a metabolic shift,
which, as with the inflammatory response, was dependent on toll-like receptor 4 signaling.
These foamy macrophages also presented an increased proliferative capacity as compared to
the control macrophages. Finally, using zebrafish larvae, several of the in vitro atherogenic
properties of ChE were confirmed in vivo, namely lipid accumulation, inflammation and
macrophage lysosomal dysfunction. Altogether, the work presented here contributes to the
identification of new etiologic compounds in human atherosclerotic lesions and advances
our mechanistic understanding of the alterations observed in atherosclerotic macrophages.RESUMO: A aterosclerose é uma doença inflamatória crónica e a principal causa de morte no mundo
inteiro. Caracteriza-se pela internalização contínua de lipoproteínas de baixa densidade,
que sofreram modificações por macrófagos derivados de monócitos, levando à formação
de “células espumosas”. O nível de oxidação lipídica e a quantidade de lípido internalizada
pelos macrófagos influencia o seu fenótipo e a sua função inflamatória. Com o tempo, os
macrófagos presentes na lesão tornam-se disfuncionais e um dos principais responsáveis
por este processo é o mau funcionamento dos lisossomas. Eventualmente, esta disfunção
lisossomal leva à formação de células apoptóticas e à acumulação de lípidos tóxicos na
íntima arterial, culminando na formação de um ateroma de estado avançado e irreversível.
Deste modo, o estabelecimento de uma correlação entre a composição das espécies lipídicas
e a irreversibilidade/instabilidade da lesão pode contribuir para o desenvolvimento de
ferramentas fundamentais no diagnóstico e tratamento de doenças cardiovasculares. O
objetivo principal deste trabalho foi o estudo de hemiesteres de colesterol (ChE), produtos
resultantes da oxidação de ésteres de colesterol, como compostos aterogénicos. Neste
trabalho, através da utilização da técnica de lipidómica “shotgun”, demonstramos que os
ChE estão aumentados no plasma de pacientes com doenças cardiovasculares. De seguida,
avaliamos a relevância aterogénica destes lípidos oxidados, através de estudos in vitro e in
vivo. Monócitos e macrófagos expostos a ChE apresentaram um perfil inflamatório incomum,
exibindo marcadores pró- e anti-inflamatórios. Os macrófagos carregados de ChE revelaram
atrasos no tráfego endocítico e um aumento do tamanho dos seus lisossomas, assim
como uma perda da sua função. Observou-se, também, uma alteração da localização dos
lisossomas stressados nas células tratadas com ChE, verificando-se uma distribuição mais
periférica, enquanto as células controlo apresentam uma distribuição mais homogénea dos
lisossomas. Estes lisossomas de macrófagos carregados com ChE demonstraram um aumento
adicional da sua capacidade exocítica. Além disso, os macrófagos estimulados com ChE revelaram
uma alteração metabólica, que juntamente com a resposta inflamatória, foi dependente
da sinalização através do receptor “toll like receptor-4”. Os macrófagos “espumosos”
apresentaram, ainda, um aumento da capacidade proliferativa em relação aos macrófagos
controlo. Finalmente, usando larvas de peixe-zebra, várias propriedades aterogénicas dos
ChE observadas in vitro foram confirmadas in vivo, nomeadamente, a acumulação de lípidos,
a propriedade inflamatória e a disfunção lisossomal em macrófagos. Em suma, o trabalho
aqui apresentado contribui para a identificação de novos compostos etiológicos nas lesões
de aterosclerose humana e contribui para o avanço da nossa compreensão mecanística das
alterações celulares nos macrófagos das lesões
