High genotypic diversity and a novel variant of human cytomegalovirus revealed by combined UL33/UL55 genotyping with broad-range PCR

The known strains of human cytomegalovirus (HCMV) represent genotypic variants of a single species, and HCMV genotypic variability has been studied in order to reveal correlations between different disease patterns and the presence of certain HCMV genotypes, either as single or as multiple infections. The methods used for the detection of HCMV genotypes have not always been sophisticated enough to achieve complete comprehensiveness, mainly because only one genotype is usually detected in a certain specimen, due to primer specificity and genome copy number. To improve detection of variant HCMV genotypes in mixed infections, we developed PCR assays with degenerate primers targeting two variable HCMV genes, glycoprotein B (gB, UL55) and the G-protein-coupled receptor gene UL33. Primers were designed to bind conserved sites in the genomes of HCMV variants and great ape CMVs. To analyse if samples contained one or more HCMV genotypic variants, PCR assays were supplemented with oligonucleotides containing locked nucleic acids. This broad-range PCR methodology and subsequent sequence analysis detected all gB/UL55 and UL33 genotypic variants known to date in primary clinical specimens, but also revealed that many samples contained genotype mixtures. Importantly, a novel UL33 genotypic variant could be discovered in several specimens, and one HCMV isolate was plaque-purified containing the novel UL33 genotype and a so far undescribed variant of gB

Variability of a glycoprotein and a G-protein-coupled receptor (UL55, UL33) of cytomegalovirus

Zytomegalie-Viren (HCMV) sind Krankheitserreger, die im Menschen lebenslang persistieren und eine Vielzahl von klinischen Manifestationen verursachen können, welche insbesondere bei immunsupprimierten Patienten auftreten. Vergleiche klinischer HCMV-Isolate zeigen multiple polymorphe Genbereiche, eine Serotypeneinteilung existiert bisher jedoch nicht. Die Versuche verschiedener Autoren, Zusammenhänge zwischen dem klinischem Ablauf einer HCMV-Infektion und bestimmten Genotypen einzelner Genbereiche festzustellen, führten bisher lediglich zu einer widersprüchlichen Studienlage, ohne unmittelbare Praxisrelevanz. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine PCR-basierte Methodik zu entwickeln, die in klinischem Probenmaterial zusätzlich auch hochdivergente Genotypen und mehrere Genotypen in einer Probe nachweisen kann. Die Entwicklung und Evaluation der Methodik erfolgte an Glykoprotein B (gB). Nachfolgend wurde die Polymorphie von UL33, einem CMV-kodierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor, untersucht. Dafür wurden degenerierte nested-PCR-Systeme entwickelt, die hochsensitiv (≤10 Kopien / μl) einen Bereich um die Schnittstelle von gB beziehungsweise das gesamte UL33-Gen amplifizieren können. An Primaten-CMV (aus Schimpansen und Gorillas) konnte durch Amplifikation teilweise bisher unbekannter gB- und UL33-Sequenzen die Vielseitigkeit beider degenerierter nested-Primersysteme bestätigt werden. Bei Untersuchungen mischinfizierter Proben mit degenerierten Primern wird, abhängig von Viruslast und Primeraffinität, vorwiegend ein Genotyp amplifiziert. Andere vorkommende Genotypen werden hingegen nicht detektiert. Um diese nicht detektierten Genotypen nachzuweisen, wurde der erstdetektierte Genotyp durch antisense-Oligonukleotide von der Amplifikation ausgeschlossen. Hierbei kamen als Nukleinsäure-Analoga locked-nucleic-acid Oligonukleotide (LNA) zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass – im Gegensatz zu Vermutungen anderer Autoren – LNA von mehr als 12 Basenpaaren Länge als spezifische antisense-Oligonukleotide dienen können. So erlaubten die für die vier gB-Genotypen synthetisierten LNA die spezifische Amplifikation eines unterrepräsentierten gB-Genotypen aus einer artifiziell vierfach mischinfizierten Probe. Nachfolgend konnten die HCMV aus 30 Proben immunsupprimierter Patienten genotypisiert werden. Hierbei ergaben sich Hinweise darauf, dass der Anteil gB-mehrfachinfizierter Immunsupprimierter höher ist, als derzeit vermutet. Folgende Bezeichnungen von UL33-Genotypen wurden vorgenommen: Stamm Merlin als UL33-1, Stamm Toledo als UL33-2 und Stamm AD169 als UL33-3. Genotyp UL33-4 konnte erstmals in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Die Sequenzanalyse des putativen, gespleißten Proteinprodukts zeigte den neuen Genotypen als divergentesten mit größter Ähnlichkeit zu UL33-1 mit 94% Übereinstimmung auf Aminosäureebene. In der Gruppe der immunsupprimierten Patientenproben wurden die UL33-Genotypen 1-3 mit abnehmender Häufigkeit nachgewiesen. Insgesamt 30% der Proben zeigten HCMV-Infektionen mit mehreren UL33-Genotypen. Vergleiche der Sequenzvariabilität mit Strukturberechnungen des UL33-Rezeptors lassen eine Variabilität vor allem der extrazellulären Rezeptoranteile vermuten. Daher sollten zukünftige Studien zum Nachweis des natürlichen Liganden von UL33 unter anderem auch mit UL33-1 erfolgen. Die UL33-nested-PCR und die zugehörigen LNA ermöglichten die Amplifikation des kompletten UL33-Gens mit allen seinen genotypischen Varianten. Die in dieser Arbeit entwickelte Methodik erlaubt den Nachweis bisher unbekannter hochdivergenter CMV-Genotypen und zeigt erstmals die Funktionalität von reinen LNA als inhibierende antisense-Oligonukleotide in degenerierten PCR

Variability of a glycoprotein and a G-protein-coupled receptor (UL55, UL33) of cytomegalovirus

Zytomegalie-Viren (HCMV) sind Krankheitserreger, die im Menschen lebenslang persistieren und eine Vielzahl von klinischen Manifestationen verursachen können, welche insbesondere bei immunsupprimierten Patienten auftreten. Vergleiche klinischer HCMV-Isolate zeigen multiple polymorphe Genbereiche, eine Serotypeneinteilung existiert bisher jedoch nicht. Die Versuche verschiedener Autoren, Zusammenhänge zwischen dem klinischem Ablauf einer HCMV-Infektion und bestimmten Genotypen einzelner Genbereiche festzustellen, führten bisher lediglich zu einer widersprüchlichen Studienlage, ohne unmittelbare Praxisrelevanz. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine PCR- basierte Methodik zu entwickeln, die in klinischem Probenmaterial zusätzlich auch hochdivergente Genotypen und mehrere Genotypen in einer Probe nachweisen kann. Die Entwicklung und Evaluation der Methodik erfolgte an Glykoprotein B (gB). Nachfolgend wurde die Polymorphie von UL33, einem CMV-kodierten G -Protein-gekoppelten Rezeptor, untersucht. Dafür wurden degenerierte nested- PCR-Systeme entwickelt, die hochsensitiv (≤10 Kopien / µl) einen Bereich um die Schnittstelle von gB beziehungsweise das gesamte UL33-Gen amplifizieren können. An Primaten-CMV (aus Schimpansen und Gorillas) konnte durch Amplifikation teilweise bisher unbekannter gB- und UL33-Sequenzen die Vielseitigkeit beider degenerierter nested-Primersysteme bestätigt werden. Bei Untersuchungen mischinfizierter Proben mit degenerierten Primern wird, abhängig von Viruslast und Primeraffinität, vorwiegend ein Genotyp amplifiziert. Andere vorkommende Genotypen werden hingegen nicht detektiert. Um diese nicht detektierten Genotypen nachzuweisen, wurde der erstdetektierte Genotyp durch antisense-Oligonukleotide von der Amplifikation ausgeschlossen. Hierbei kamen als Nukleinsäure-Analoga locked-nucleic-acid Oligonukleotide (LNA) zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass – im Gegensatz zu Vermutungen anderer Autoren – LNA von mehr als 12 Basenpaaren Länge als spezifische antisense-Oligonukleotide dienen können. So erlaubten die für die vier gB-Genotypen synthetisierten LNA die spezifische Amplifikation eines unterrepräsentierten gB-Genotypen aus einer artifiziell vierfach mischinfizierten Probe. Nachfolgend konnten die HCMV aus 30 Proben immunsupprimierter Patienten genotypisiert werden. Hierbei ergaben sich Hinweise darauf, dass der Anteil gB-mehrfachinfizierter Immunsupprimierter höher ist, als derzeit vermutet. Folgende Bezeichnungen von UL33-Genotypen wurden vorgenommen: Stamm Merlin als UL33-1, Stamm Toledo als UL33-2 und Stamm AD169 als UL33-3. Genotyp UL33 4 konnte erstmals in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Die Sequenzanalyse des putativen, gespleißten Proteinprodukts zeigte den neuen Genotypen als divergentesten mit größter Ähnlichkeit zu UL33-1 mit 94% Übereinstimmung auf Aminosäureebene. In der Gruppe der immunsupprimierten Patientenproben wurden die UL33-Genotypen 1-3 mit abnehmender Häufigkeit nachgewiesen. Insgesamt 30% der Proben zeigten HCMV-Infektionen mit mehreren UL33-Genotypen. Vergleiche der Sequenzvariabilität mit Strukturberechnungen des UL33-Rezeptors lassen eine Variabilität vor allem der extrazellulären Rezeptoranteile vermuten. Daher sollten zukünftige Studien zum Nachweis des natürlichen Liganden von UL33 unter anderem auch mit UL33-1 erfolgen. Die UL33 -nested-PCR und die zugehörigen LNA ermöglichten die Amplifikation des kompletten UL33-Gens mit allen seinen genotypischen Varianten. Die in dieser Arbeit entwickelte Methodik erlaubt den Nachweis bisher unbekannter hochdivergenter CMV-Genotypen und zeigt erstmals die Funktionalität von reinen LNA als inhibierende antisense-Oligonukleotide in degenerierten PCR.Cytomegalovirus infections can cause serious problems in fetus, newborns and immunocompromised patients, and viral DNA is usually detected with specific PCR. An unprejudiced way of analysing human samples for the presence of known and unknown cytomegalovirus genotypes is to use degenerate primers. However, in mixed infections, only one dominant genotype is usually amplified. Here, we present a modification of degenerate nested PCR by utilizing oligonucleotides of locked nucleic acids (LNA) to specifically block the genotype sequence which is preferentially amplified in the PCR reaction. This technology was used to detect and differentiate genotypic variants of the glycoprotein B gene (UL55) and a G-protein-coupled receptor gene (UL33) of human cytomegalovirus (HCMV). Two nested degenerate primer pairs were designed which broadly amplified hominoid CMV (from men and chimpanzees). With the help of UL55- and UL33-specific LNA, a collection of clinical samples was differentially screened for the occurrence of multiple infections with HCMV genotypes. The five gB and the three UL33 genotypic variants known to date were identified, and a novel fourth UL33 genotype was discovered

Telehealth Needs and Concerns of Stakeholders in Pediatric Palliative Home Care

Pediatric palliative home care (PPHC) provides care for children, adolescents, and young adults with life-limiting illnesses in their own homes. Home care often requires long travel times for the PPHC team, which is available to the families 24/7 during crises. The complementary use of telehealth may improve the quality of care. In this pilot study we identify the needs and concerns of patients, teams, and other stakeholders regarding the introduction of telehealth. As a first step, focus groups were conducted in three teams. For the second step, semi-structured interviews were conducted with patients and their families (n = 15). Both steps were accompanied by quantitative surveys (mixed methods approach). The qualitative data were analyzed using content analysis. A total of 11 needs were identified, which were prioritized differently. Highest priority was given to: data transmission, video consultation, access to patient records, symptom questionnaires, and communication support. The concerns identified were related to the assumption of deterioration of the status quo. Potential causes of deterioration were thought to be the negative impact on patient care, inappropriate user behavior, or a high level of technical requirements. As a conclusion, we define six recommendations for telehealth in PPHC

Novel cytomegaloviruses in free-ranging and captive great apes:phylogenetic evidence for bidirectional horizontal transmission

Wild great apes often suffer from diseases of unknown aetiology. This is among the causes of population declines. Because human cytomegalovirus (HCMV) is an important pathogen, especially in immunocompromised individuals, a search for cytomegaloviruses (CMVs) in deceased wild and captive chimpanzees, gorillas and orang-utans was performed. By using a degenerate PCR targeting four conserved genes (UL54-UL57), several distinct, previously unrecognized CMVs were found for each species. Sequences of up to 9 kb were determined for ten novel CMVs, located in the UL54-UL57 block. A phylogenetic tree was inferred for the ten novel CMVs, the previously characterized chimpanzee CMV, HCMV strains and Old World and New World monkey CMVs. The primate CMVs fell into four clades, containing New World monkey, Old World monkey, orang-utan and human CMVs, respectively, plus two clades that each contained both chimpanzee and gorilla isolates (termed CG1 and CG2). The tree loci of the first four clades mirrored those for their respective hosts in the primate tree, suggesting that these CMV lineages arose through cospeciation with host lineages. The CG1 and CG2 loci corresponded to those of the gorilla and chimpanzee hosts, respectively. This was interpreted as indicating that CG1 and CG2 represented CMV lineages that had arisen cospeciationally with the gorilla and chimpanzee lineages, respectively, with subsequent transfer within each clade between the host genera. Divergence dates were estimated and found to be consistent with overall cospeciational development of major primate CMV lineages. However, CMV transmission between chimpanzees and gorillas in both directions has also occurred