The association of CD81 with tetraspanin-enriched microdomains is not essential for Hepatitis C virus entry

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Three percent of the world's population is chronically infected with hepatitis C virus (HCV) and thus at risk of developing liver cancer. Although precise mechanisms regulating HCV entry into hepatic cells are still unknown, several cell surface proteins have been identified as entry factors for this virus. Among these molecules, the tetraspanin CD81 is essential for HCV entry. Interestingly, CD81 is also required for <it>Plasmodium </it>infection. A major characteristic of tetraspanins is their ability to interact with each other and other transmembrane proteins to build tetraspanin-enriched microdomains (TEM).</p> <p>Results</p> <p>In our study, we describe a human hepatoma Huh-7 cell clone (Huh-7w7) which has lost CD81 expression and can be infected by HCV when human CD81 (hCD81) or mouse CD81 (mCD81) is ectopically expressed. We took advantage of these permissive cells expressing mCD81 and the previously described MT81/MT81w mAbs to analyze the role of TEM-associated CD81 in HCV infection. Importantly, MT81w antibody, which only recognizes TEM-associated mCD81, did not strongly affect HCV infection. Furthermore, cholesterol depletion, which inhibits HCV infection and reduces total cell surface expression of CD81, did not affect TEM-associated CD81 levels. In addition, sphingomyelinase treatment, which also reduces HCV infection and cell surface expression of total CD81, raised TEM-associated CD81 levels.</p> <p>Conclusion</p> <p>In contrast to <it>Plasmodium </it>infection, our data show that association of CD81 with TEM is not essential for the early steps of HCV life cycle, indicating that these two pathogens, while using the same molecules, invade their host by different mechanisms.</p

The CD81 Partner EWI-2wint Inhibits Hepatitis C Virus Entry

Two to three percent of the world's population is chronically infected with hepatitis C virus (HCV) and thus at risk of developing liver cancer. Although precise mechanisms regulating HCV entry into hepatic cells are still unknown, several cell surface proteins have been identified as entry factors for this virus. Among these molecules, the tetraspanin CD81 is essential for HCV entry. Here, we have identified a partner of CD81, EWI-2wint, which is expressed in several cell lines but not in hepatocytes. Ectopic expression of EWI-2wint in a hepatoma cell line susceptible to HCV infection blocked viral entry by inhibiting the interaction between the HCV envelope glycoproteins and CD81. This finding suggests that, in addition to the presence of specific entry factors in the hepatocytes, the lack of a specific inhibitor can contribute to the hepatotropism of HCV. This is the first example of a pathogen gaining entry into host cells that lack a specific inhibitory factor

Receptor Complementation and Mutagenesis Reveal SR-BI as an Essential HCV Entry Factor and Functionally Imply Its Intra- and Extra-Cellular Domains

HCV entry into cells is a multi-step and slow process. It is believed that the initial capture of HCV particles by glycosaminoglycans and/or lipoprotein receptors is followed by coordinated interactions with the scavenger receptor class B type I (SR-BI), a major receptor of high-density lipoprotein (HDL), the CD81 tetraspanin, and the tight junction protein Claudin-1, ultimately leading to uptake and cellular penetration of HCV via low-pH endosomes. Several reports have indicated that HDL promotes HCV entry through interaction with SR-BI. This pathway remains largely elusive, although it was shown that HDL neither associates with HCV particles nor modulates HCV binding to SR-BI. In contrast to CD81 and Claudin-1, the importance of SR-BI has only been addressed indirectly because of lack of cells in which functional complementation assays with mutant receptors could be performed. Here we identified for the first time two cell types that supported HCVpp and HCVcc entry upon ectopic SR-BI expression. Remarkably, the undetectable expression of SR-BI in rat hepatoma cells allowed unambiguous investigation of human SR-BI functions during HCV entry. By expressing different SR-BI mutants in either cell line, our results revealed features of SR-BI intracellular domains that influence HCV infectivity without affecting receptor binding and stimulation of HCV entry induced by HDL/SR-BI interaction. Conversely, we identified positions of SR-BI ectodomain that, by altering HCV binding, inhibit entry. Finally, we characterized alternative ectodomain determinants that, by reducing SR-BI cholesterol uptake and efflux functions, abolish HDL-mediated infection-enhancement. Altogether, we demonstrate that SR-BI is an essential HCV entry factor. Moreover, our results highlight specific SR-BI determinants required during HCV entry and physiological lipid transfer functions hijacked by HCV to favor infection

Etude de la multiplication de la souche JFH-1 du virus de l'hépatite C (VHC) en cellules Huh-7 (adaptation et sélection de mutations permettant une production rapide et massive du VHC, localisation subcellulaire de protéines du VHC, mise en évidence de clones cellulaires résistants à l'infection par le VHC)

Notre étude sur le virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 2a a initialement été entreprise pour pallier le problème lié à la production virale du VHC. Ayant obtenu des titres comparables à ceux publiés, nous avons cherché à développer une approche expérimentale nous permettant de les améliorer. Pour cela, nous avons effectué des infections successives de cellules Huh-7 naïves. Nous avons montré, dans un premier temps, qu'il était possible d'obtenir des cellules Huh-7 chroniquement infectées pendant plusieurs mois. La localisation subcellulaire des protéines structurales, telles que la protéine de la capside et les glycoprotéines E1 et E2, ou de la protéine non structurale NS3 a alors été réexaminée dans le contexte d'un cycle infectieux du VHC. L'analyse de la localisation subcellulaire des protéines structurales du VHC, en immunofluorescence en microscopie confocale, a confirmé que les glycoprotéines E1 et E2 sont maintenues dans le réticulum endoplasmique des cellules infectées. Cependant, et contrairement à d'autres études, ces glycoprotéines ne s'accumulent pas dans les autres compartiments intracellulaires ou à la surface cellulaire. L'association entre la protéine de la capside et les gouttelettes lipidiques a également été confirmée. Cependant, contrairement à certaines études précédentes, la protéine C n'a pas été trouvée dans le noyau de la cellule ou en association avec des mitochondries. De façon surprenante, nous n'avons pas observé de colocalisation entre les hétérodimères E1E2 et la protéine C en cellules infectées. Par ailleurs, nous avons observé une colocalisation partielle entre la protéine de la capside et la protéine NS3, et lorsque les gouttelettes lipidiques sont révélées la protéine NS3 se retrouve autour de ces gouttelettes. Ainsi, la localisation subcellulaire des protéines structurales du VHC a pu être étudiée pour la première fois dans le contexte d'un cycle infectieux. Dans un second temps, nous avons cherché à définir si des changements dans le génome viral du clone JFH-1 pouvaient expliquer l'augmentation des titres infectieux que nous avions obtenu au cours des infections successives des cellules Huh-7. Le séquençage de l'ARN du VHC nous a permis de déterminer qu'une mutation majeure, N534K, était apparue dans la séquence codant la glycoprotéine E2 du virus. De manière intéressante, cette mutation empêche la glycosylation d'un des sites de N-glycosylation présent sur la glycoprotéine E2. En outre, lorsque cette mutation est directement introduite dans la séquence du JFH-1, elle facilite l'infection des cellules Huh-7 naïves. Dans une deuxième approche, et fort de nos résultats obtenus dans une étude portant sur des virus chimériques 1a-2a du VHC, nous avons mis en évidence que la sécrétion des particules virales du VHC de génotype 2a pouvait être améliorée par la substitution de deux acides aminés (F172C et P173S) localisés dans la séquence codant la protéine de la capside du VHC. L'insertion de ces variations (F172C, P173S et N534K) dans le génome du VHC de génotype 2a permet de produire des titres infectieux très conséquents. Ainsi, la substitution de certains acides aminés dans la séquence codant les protéines structurales permet de produire des titres infectieux du VHC importants et indépendemment de la lignée cellulaire Huh-7 utilisée. Lors de l'étude des mutants hautement productifs du clone JFH-1, nous avons observé un phénomène de cytotoxicité important sur la lignée cellulaire Huh-7. Bien que ce phénomène ne soit pas encore expliqué, nous avons été en mesure de sélectionner plusieurs clones cellulaires résistants à cet effet cytopathique. L'analyse de ces clones a montré qu'ils étaient résistants à l'infection par le VHC. Cette résistance est le résultat de la perte d'expression d'un récépteur majeur pour l'infection du VHC, la molécule de surface CD81. L'étude de ces clones cellulaires nous a permis de confirmer le rôle primordial que joue CD81 dans l'infection par le VHC.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF

La fabrique de la laïcité par le juge, éléments de comparaison Belgique-France-Québec

Cet article propose un essai interprétatif des conditions par lesquelles le juge fabrique la laïcité, cela dans trois contextes nationaux : la Belgique, la France et le Québec. Sans nier l’important rôle du législateur, il développe l’idée selon laquelle la laïcité, dans toute sa concrétude, procède aussi et surtout d’un important travail d’interprétation par lequel les tribunaux, tantôt contribuent à préciser le contenu des principes laïques (séparation des Églises et de l’État ; neutralité ; liberté de conscience et de religion ; égalité) en dehors même de toute intervention du législateur à cet effet, tantôt contrôlent (et parfois censurent) le travail de ce dernier au nom de ces principes laïques.This article analyzes how courts « build » secularism in three national contexts : Belgium, France and Quebec. First, it argues that secularism, in all its concreteness, proceeds from an important work of interpretation by which the courts clarify, on a case by case basis, the content of secular principles (i.e. separation between Churches and State ; state neutrality ; freedom of conscience and religion ; equality). Second, the article illustrates how the courts control (and sometimes censure) the national or local legislator's work in the name of these secular principles

Revue Interdisciplinaire d’Etudes Juridiques, « La laïcité dans la balance. Le juge, quel régulateur des relations entre l’Etat et les religions ? »

International audienc

Expression of hepatitis C virus (HCV) structural proteins in trans facilitates encapsidation and transmission of HCV subgenomic RNA

A characteristic of many positive-strand RNA viruses is that, whilst replication of the viral genome is dependent on the expression of the majority of non-structural proteins in cis, virus particle formation can occur when most or all of the structural proteins are co-expressed in trans. Making use of a recently identified hepatitis C virus (HCV) isolate (JFH1) that can be propagated in tissue culture, this study sought to establish whether this is also the case for hepaciviruses. Stable cell lines containing one of two bicistronic replicons derived from the JFH1 isolate were generated that expressed non-structural proteins NS3-5B or NS2-5B. Release and transmission of these replicons to naïve Huh7 cells could then be demonstrated when baculovirus transduction was used to express the HCV proteins absent from the subgenomic replicons. Transmission could be blocked by a neutralizing antibody targeted at the E2 envelope protein, consistent with this phenomenon occurring via trans-encapsidation of replicon RNA into virus-like particles. Transmission was also dependent on expression of NS2, which was most effective at promoting virus particle formation when expressed in cis on the replicon RNA compared with in trans via baculovirus delivery. Density gradient analysis of the particles revealed the presence of a broad infectious peak between 1.06 and 1.11 g ml(-1), comparable to that seen when propagating full-length virus in tissue culture. In summary, the trans-encapsidation system described offers a complementary and safer approach to study HCV particle formation and transmission in tissue culture