Human HLTF mediates postreplication repair by its HIRAN domain-dependent replication fork remodelling

Defects in the ability to respond properly to an unrepaired DNA lesion blocking replication promote genomic instability and cancer. Human HLTF, implicated in error-free replication of damaged DNA and tumour suppression, exhibits a HIRAN domain, a RING domain, and a SWI/SNF domain facilitating DNA-binding, PCNA-polyubiquitin-ligase, and dsDNA-translocase activities, respectively. Here, we investigate the mechanism of HLTF action with emphasis on its HIRAN domain. We found that in cells HLTF promotes the filling-in of gaps left opposite damaged DNA during replication, and this postreplication repair function depends on its HIRAN domain. Our biochemical assays show that HIRAN domain mutant HLTF proteins retain their ubiquitin ligase, ATPase and dsDNA translocase activities but are impaired in binding to a model replication fork. These data and our structural study indicate that the HIRAN domain recruits HLTF to a stalled replication fork, and it also provides the direction for the movement of the dsDNA translocase motor domain for fork reversal. In more general terms, we suggest functional similarities between the HIRAN, the OB, the HARP2, and other domains found in certain motor proteins, which may explain why only a subset of DNA translocases can carry out fork reversal

Lysosomal integral membrane protein-2 (LIMP-2/SCARB2) is involved in lysosomal cholesterol export

The intracellular transport of cholesterol is subject to tight regulation. The structure of the lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2, also known as SCARB2) reveals a large cavity that traverses the molecule and resembles the cavity in SR-B1 that mediates lipid transfer. The detection of cholesterol within the LIMP-2 structure and the formation of cholesterol - like inclusions in LIMP-2 knockout mice suggested the possibility that LIMP2 transports cholesterol in lysosomes. We present results of molecular modeling, crosslinking studies, microscale thermophoresis and cell-based assays that support a role of LIMP-2 in cholesterol transport. We show that the cavity in the luminal domain of LIMP-2 can bind and deliver exogenous cholesterol to the lysosomal membrane and later to lipid droplets. Depletion of LIMP-2 alters SREBP-2-mediated cholesterol regulation, as well as LDL-receptor levels. Our data indicate that LIMP-2 operates in parallel with Niemann Pick (NPC)-proteins, mediating a slower mode of lysosomal cholesterol export.Peer reviewe

Cyclopentadienyl freie Komplexe von p, d und f Elementen

Eines der Haupziele dieser Doktorarbeit war die Begründung einer allgemeinen Route für die Herstellung Cp-freier bis-hydrocarbyl Komplexe der 4f Metalle, LLnR2. Unter Berücksichtigung des Lewissäure-Characters der Lanthanid-Kationen und des gewünschten Zieles, wurde der monoanionische Ligand L = [N,N''-(1,3-dimethyl-1,3-propandiyliden)bis[N',N'-diethyl-1,2-ethandiamin]] gestaltet, um Salz- und THF- Koordinierung, Dimerisierung, und Ligandenumverteilung zu verhindern. Nach der Herstellung der konjugierten Säure des Liganden L konnte eine reiche Chemie mit Hauptgruppen-Metallen, Übergangsmetallen, und Lanthaniden, z.B. LPrCl2 oder LTbBr2, entwickelt werden. Auf der anderen Seite erwies sich die Metathese kompliziert und sehr abhängig von den Reaktionsbedingungen. Durch Salzeliminierung konnte nur LTb(CH2SiMe3)2 dargestellt werden und es ist komplett charakterisiert worden. Diese Ausgangsverbindungen konnten auch andere Metathesen eingehen, wie z.B. mit NaBH4. Die Vielfältigkeit des Liganden L ist bei der Erweiterung seiner Chemie mit Komplexen von Aluminium und Vanadium demonstriert worden. Verbindungen wie LAlCl2, LAlMe2, und LVCl2 wurden ohne Probleme dargestellt. Bei der Reaktion der Ausgangverbindung LAlMe2 mit einer starken Brønsted Säure H2O·B(C6F5)3 konnten unter verschiedenen Reaktionsbedingungen das erstes Monoaluminoxan und sein Isomer isoliert werden. Bei den Versuchen, ein Aluminiumimid herzustellen, durch die Reaktion zwischen LAlMe2 und H3N·B(C6F5)3, ist nur eine Zwischenstufe LAl(Me)NH2·B(C6F5)3 erreicht worden. Die Chemie der b-Diketiminato-Liganden mit Titan, Vanadium oder Chrom ist weniger entwickelt als die mit Aluminum. Entsprechend wurden einige Vanadiumkomplexe mit dem Liganden L synthetisiert: LV(OSO2CF3)2, das erstes Vanadium(III)-triflat strukturell charakterisiert und der erste strukturell charakterisierte End-phosphido Komplex von Vanadium(II) LVPPh2. Die Suche nach einem neuen monoanionischen b-Diketiminato Liganden ist aus dem Misserfolg des Liganden L für die höheren der zweiten und dritten Reihe der Übergangsmetalle entstanden. Ein neuer Ligand L' = [N,N'-(1,3-dimethyl-1,3-propandiyliden)bis[2-diphenylphosphanyl-ethylamin]]-, der Phosphor-Donoratome statt Stickstoff-Donoratomen enthält ist dargestellt worden. Das Kaliumsalz L'K, in situ hergestellt, hat leicht mit [m-ClRh(CO)2]2 reagiert unter Bildung einer sehr stabilen Rhodium(I) Verbindung. Die Reaktion mit YCl3 hat zu L'2YCl geführt

Structure of the unphosphorylated STAT5a dimer

STAT proteins have the function of signaling from the cell membrane into the nucleus, where they regulate gene transcription. Latent mammalian STAT proteins can form dimers in the cytoplasm even before receptor-mediated activation by specific tyrosine phosphorylation. Here we describe the 3.21-A crystal structure of an unphosphorylated STAT5a homodimer lacking the N-terminal domain as well as the C-terminal transactivation domain. The overall structure of this fragment is very similar to phosphorylated STATs. However, important differences exist in the dimerization mode. Although the interface between phosphorylated STATs is mediated by their Src-homology 2 domains, the unphosphorylated STAT5a fragment dimerizes in a completely different manner via interactions between their beta-barrel and four-helix bundle domains. The STAT4 N-terminal domain dimer can be docked onto this STAT5a core fragment dimer based on shape and charge complementarities. The separation of the dimeric arrangement, taking place upon activation and nuclear translocation of STAT5a, is demonstrated by fluorescence resonance energy transfer experiments in living cells