Struktur-Teratogenitäts-Studien von Valproinsäure-Analogen : Inhibierung von Histondeacetylasen und Pharmakokinetik ausgewählter Derivate im Mausmodell

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Cellular expression and crystal structure of the murine cytomegalovirus MHC-Iv glycoprotein, m153

Mouse cytomegalovirus (MCMV), a β-herpesvirus that establishes latent and persistent infections in mice, is a valuable model for studying complex virus-host interactions. MCMV encodes the m145 family of putative immunoevasins with predicted MHC-I structure. Functions attributed to some family members include downregulation of host MHC-I (m152) and NKG2D ligands (m145, m152, m155) and interaction with inhibitory or activating NK receptors (m157). We present the cellular, biochemical and structural characterization of m153, which is a heavily glycosylated homodimer, that does not require β2m or peptide, and is expressed at the surface of MCMV-infected cells. Its 2.4 Å crystal structure confirms that this compact molecule preserves an MHC-I-like fold and reveals a novel mode of dimerization, confirmed by site-directed mutagenesis, and a distinctive disulfide-stabilized extended amino terminus. The structure provides a useful framework for comparative analysis of the divergent members of the m145 family

A novel chromatographic method allows online reanalyses in proteomic investigations and acquiring more information from biological samples

Comunicaciones a congreso

The Embryonic Stem Cell Test as Tool to Assess Structure-Dependent Teratogenicity: The Case of Valproic Acid

Teratogenicity can be predicted in vitro using the embryonic stem cell test (EST). The EST, which is based on the morphometric measurement of cardiomyocyte differentiation and cytotoxicity parameters, represents a scientifically validated method for the detection and classification of chemicals according to their teratogenic potency. Furthermore, an abbreviated protocol applying flow cytometry of intracellular marker proteins to determine differentiation into the cardiomyocyte lineage is available. Although valproic acid (VPA) is in worldwide clinical use as antiepileptic drug, it exhibits two severe side effects, i.e., teratogenicity and hepatotoxicity. These limitations have led to extensive research into derivatives of VPA. Here we chose VPA as model compound to test the applicability domain and to further evaluate the reliability of the EST. To this end, we study six closely related congeners of VPA and demonstrate that both the standard and the molecular flow cytometry-based EST are well suited to indicate differences in the teratogenic potency among VPA analogs that differ only in chirality or side chain length. Our data show that identical results can be obtained by using the standard EST or a shortened protocol based on flow cytometry of intracellular marker proteins. Both in vitro protocols enable to reliably determine differentiation of murine stem cells toward the cardiomyocyte lineage and to assess its chemical-mediated inhibition

Cellular Expression and Crystal Structure of the Murine Cytomegalovirus Major Histocompatibility Complex Class I-like Glycoprotein, m153

Mouse cytomegalovirus (MCMV), a β-herpesvirus that establishes latent and persistent infections in mice, is a valuable model for studying complex virus-host interactions. MCMV encodes the m145 family of putative immunoevasins with predicted MHC-I structure. Functions attributed to some family members include downregulation of host MHC-I (m152) and NKG2D ligands (m145, m152, m155) and interaction with inhibitory or activating NK receptors (m157). We present the cellular, biochemical and structural characterization of m153, which is a heavily glycosylated homodimer, that does not require β2m or peptide, and is expressed at the surface of MCMV-infected cells. Its 2.4 Å crystal structure confirms that this compact molecule preserves an MHC-I-like fold and reveals a novel mode of dimerization, confirmed by site-directed mutagenesis, and a distinctive disulfide-stabilized extended amino terminus. The structure provides a useful framework for comparative analysis of the divergent members of the m145 family

Comparação entre heparina de baixo peso molecular e heparina não fraccionada intravenosa no tratamento da embolia pulmonar â Uma meta-análise de estudos controlados randomizados

RESUMO: O tratamento da embolia pulmonar aguda (EPA) com heparina de baixo peso molecular não é consensual. Muitos clínicos continuam a utilizar a heparina não fraccionada por considerarem que o EPA apresenta maior risco do que a trombose venosa profunda (TVP) e por admitirem insuficientes as provas de eficácia e segurança relativas à heparina de baixo peso molecular.à indiscutível a maior facilidade de utilização das heparinas de baixo peso molecular. O propósito desta meta-análise é comparar a eficácia e segurança de uma dose fixa subcutânea de heparina de baixo peso molecular com uma dose variável intravenosa de heparina não fraccionada. Foram incluídos ensaios clínicos com casos de EPA sintomático ou de EPA assintomático com TVP sintomática. A variável principal foi a recorrência de tromboembolismo venoso sintomático (incluindo EPA e TVP) no final do tratamento (entre 5 e 14 dias); as variáveis secundárias foram a recorrência de tromboembolismo aos 3 meses, a mortalidade e a hemorragia major ou minor. No estudo comparativo com a heparina não fraccionada foram utilizadas 6 diferentes heparinas de baixo peso molecular, e a análise total envolveu mais de 1900 doentes repartidos por 12 estudos. Os resultados mostraram: ⢠Redução do número de casos de recorrência de tromboembolismo venoso sintomático com a heparina de baixo peso molecular comparativamente à heparina não fraccionada - 14/1023 vs 22/928. ⢠Redução do número de casos de recorrência de tromboembolismo venoso ao final de 3 meses, nos doentes tratados com heparina de baixo peso molecular - 30/988 vs 39/895. ⢠Mortalidade semelhante nos 2 grupos terapêuticos, quer no final do tratamento quer ao terceiro mês - 14/1023 vs 11/928 e 46/988 vs 55/895, respectivamente. ⢠A hemorragia major foi mais frequente no grupo tratado com heparina não fraccionada (2,3% contra 1,4%). A hemorragia minor foi mais frequente no grupo tratado com heparina de baixo peso molecular (6,8% contra 5,5%). ⢠Não foi evidenciada diferença na eficácia e segurança entre os 6 diferentes tipos de heparina de baixo peso molecular. Os autores concluem que a heparina de baixo peso molecular em dose fixa parece apresentar eficácia e segurança sobreponível à heparina não fraccionada em doses ajustáveis para o tratamento inicial do embolismo pulmonar não maciço. COMENTÃRIO: As heparinas de baixo peso molecular são manufacturadas por despolimerização da heparina não fraccionada. Ao contrário da heparina não fraccionada, que tem uma actividade equivalente contra o factor Xa e a trombina, as heparinas de baixo peso têm maior actividade contra o factor Xa Assim, espera-se que estas últimas apresentem actividade anti-trombótica pelo menos igual à da heparina convencional com menor risco de hemorragia. As propriedades farmacocinéticas são favoráveis às heparinas de baixo peso, que se ligam menos às proteínas do plasma, às células sanguíneas e ao endotélio, resultando em maior biodisponibilidade, semi-vida e regularidade da resposta anticoagulante. Isto permite uma a duas tomas diárias e ausência de monitorização laboratorial (excepto nos casos de insuficiência renal grave ou obesidade excessiva). O risco de trombocitopenia também é considerado menor com este tipo de heparina. A EPA e a TVP são hoje em dia reconhecidas como diferentes manifestações da mesma entidade, no seu conjunto conhecida como tromboembolismo venoso. Assim poderá esperar-se uma resposta semelhante ao tratamento com heparina de baixo peso molecular. Uma meta-análise prévia avaliou a eficácia e segurança do tratamento da TVP com heparina de baixo peso molecular e heparina não fraccionada, e concluiu serem comparáveisâ. O mesmo tipo de análise foi efectuada para o tratamento da EPA e, de facto, demonstra resultados semelhantes â a presente meta-análise suporta o uso de heparina de baixo peso molecular como tratamento de primeira linha do embolismo pulmonar não maciço. Embora alguns dos 12 estudos envolvessem um pequeno número de doentes, o THESEE study group contou com 608 doentes e concluiu pela eficácia e segurança semelhantes entre os dois tipos de heparinas. Neste estudo foi utilizada tinzaparina e em outro mais recente, também incluído na meta-análise, foi comparada a enoxiparina com a heparina convencional em 287 doentes com embolismo pulmonar confirmado. Também nesta análise a eficácia e segurança da heparina de baixo peso molecular foi semelhante à da heparina não fraccionada. A meta-análise não encontra diferenças entre os tipos de heparina de baixo peso molecularutilizados, contudo a análise é prejudicada pelo pequeno número de estudos envolvido12, comparativamente ao elevado número de heparinas utilizado6. Relativamente ao risco de hemorragia, convém realçar duas situações. Primeiro, a ausência de infusão contínua observável no doente sob heparina de baixo peso não deve fazer o clínico esquecer os riscos da anticoagulação quando de procedimentos técnicos envolvendo vasos sanguíneos. Segundo, nos doentes de alto risco para hemorragia é prudente o uso da heparina não fraccionada, dado poder ser descontinuada abruptamente. Palavras-chave: Tromboembolismo venoso, embolismo pulmonar, trombose venosa profunda, heparina não fraccionada, heparina de baixo peso molecula

Increased human cytomegalovirus replication in fibroblasts after treatment with therapeutical plasma concentrations of valproic acid.

Valproic acid (2-propylpentanoic acid, VPA), an effective inhibitor of histone deacetylases (HDAC) is used for the treatment of epilepsia. In this study, structure-activity relationships for the action of structurally modified VPA derivatives on human cytomegalovirus (HCMV) replication and HDAC inhibition were defined. Pretreatment of human foreskin fibroblasts with VPA (0.125-1mM) caused a concentration-dependent increase of HCMV immediate early and antigen late antigen expression. Structure-activity relationships of VPA derivatives for HCMV stimulation were compared to those for teratogenic action and those for HDAC inhibition. Side chain elongation and introduction of a triple bond in 4-position of the other chain caused teratogenicity, stimulated HCMV replication, and increased HDAC inhibition, as demonstrated by enhanced levels of acetylated histones. Teratogenic VPA derivatives with a branched chain in 3-position as well as a non-teratogenic anticonvulsive active VPA derivative did not stimulate HCMV or accumulation of acetylated histones. This demonstrates a strict correlation between inhibition of HDAC and increased HCMV replication