Co-encapsulação de alfa-bisabolol e doxorrubicina em nanocápsulas multiparede funcionalizadas com RGD : avaliação das atividades antitumoral e antiangiogênica

O glioblastoma é um tumor cerebral agressivo que apresenta alta proliferação vascular. Terapias que visam à inibição da proliferação celular e da angiogênese estão sob investigação. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a coencapsulação de alfa-bisabolol (AB) e doxorrubicina (DOX) em nanocápsulas multiparede funcionalizadas com tripeptídeo RGD (ácido arginilglicilaspártico) (ABDOX- MLNC-RGD) quanto ao seu potencial antitumoral e antiangiogênico. As formulações foram preparadas por deposição interfacial de polímero pré-formado, revestidas com quitosana e funcionalizadas com acetato de zinco e RGD. Foram avaliadas as características físico-químicas das formulações (diâmetro hidrodinâmico médio (dh)), concentração de partículas, potencial zeta, pH, doseamento e eficiência de encapsulação (EE) do AB e da DOX, eficiência de ligação do RGD, investigação da presença de cristais de fármaco e avaliação por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), bem como, atividade antitumoral frente linhagem de células de glioblastoma (U87MG) e a atividade antiangiogênica em ensaio na membrana corioalantoide de ovos embrionados. O dh da formulação ABDOX- MLNC-RGD foi de 138 nm, apresentando estreita faixa de distribuição (PDI<0,2). O diâmetro registrado por rastreamento de nanopatículas foi de 170 nm, enquanto que, a concentração de partículas registrada foi de 4,9x1012 partículas/mL. O potencial zeta da formulação foi de +13, 4 mV e o pH observado foi próximo a.4. O teor de AB foi próximo ao teórico e a EE próxima a 100%, já o teor de DOX foi de 30,79 μg/mL e a EE foi de 65,89%. Não foram evidenciados cristais de fármaco na fase contínua da formulação. Modos vibracionais característicos das matérias-primas que constituem a formulação estavam presentes no espectro de FT-IR. Após 24h de exposição das células U87MG à formulação AB-DOX-MLNC-RGD, o IC50 registrado foi de 2,78 μmol/L de doxorubicina. A atividade antiangiogênica foi registrada após 48h de exposição à formulação AB-DOX-MLNC-RGD, sem evidências de toxicidade para os embriões.Glioblastoma is an aggressive brain tumor that has high vascular proliferation. Therapies aimed at inhibiting cell proliferation and angiogenesis are under investigation. In this context, the aim of this study was to evaluate the co-encapsulation of alpha-bisabolol (AB) and doxorubicin (DOX) in multiwall lipid-core nanocapsule functionalized with tripeptide RGD (argynilglycilaspartic acid) (AB-DOX-MLNC-RGD) as to its antitumoral and antiangiogenic potential. The formulations were prepared by interfacial deposition of preformed polymer, coated with chitosan and functionalized with zinc acetate and RGD. The physicochemical characteristics of the formulations was evaluate (mean hydrodynamic diameter (dh)), particle concentration, zeta potential, pH, dosage and encapsulation efficiency (EE%) of AB and DOX, RGD binding efficiency, investigation of the presence of drug crystals, and evaluation by Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy as well as antitumor activity against U87MG glioblastoma cell line and antiangiogenic activity in a chorioallantoic membrane assay (CAM). The dh of formulation AB-DOX-MLNC-RGD was 138 nm, presenting a narrow range of distribution (PDI <0.2). The diameters recorded by NTA was 170 nm, while the recorded particle concentrations was 4.9x1012 particles/mL. The recorded zeta potential was +13.4 mV and the pH observed was near 4. The AB content was close to the theoretical value and the EE was close to 100%, the DOX content was. No drug crystals were evident in the continuous phase of the formulation. Vibration modes characteristic of the raw materials constituting the formulation were present in the FT-IR spectrum. After 24h of exposure of U87MG cells to the AB-DOX-MLNC-RGD formulation, the registered IC50 was 2.78 μmol/L of doxorubicin. The antiangiogenic activity was recorded after 48 h of exposure to the AB-DOX-MLNC-RGD formulation, with no evidence of toxicity to the embryos

PROFESSOR JUAREZ ALAOR SCHMIDT: UMA TRAJETÓRIA ACADÊMICA DEDICADA À UNISC

Atividades desenvolvidas pelo professor Juarez Alaor Schmidt enquanto professor da Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC

Identificação de três espécies de Candida por PCR em tempo real

Infecções causadas por leveduras do gênero Candida são muito prevalentes. A correta identificação da espécie é uma etapa fundamental para a escolha do tratamento adequado, mas os métodos tradicionais apresentam limitações. Assim, o objetivo do presente trabalho foi padronizar uma reação de PCR em tempo real (qPCR) para identificação de Candida albicans, C. glabrata e C. parapsilosis, que é uma técnica mais rápida para o diagnóstico. As amostras utilizadas consistiram em DNA extraído de cepas padrão. Realizou-se uma qPCR com SybrGreen® e diluições seriadas das amostras, com as mesmas condições do trabalho em que foram descritos os primers utilizados. Nesse ensaio os resultados foram satisfatórios apenas para C. parapsilosis, pois em C. albicans e C. glabrata, apesar de ocorrer a amplificação da sequência alvo, houve formação de produtos inespecíficos nas reações. Foi feita então uma análise in silico dos primers, que sugeriu não haver problemas significativos em sua construção, contudo encontrou-se alguns problemas de especificidade para C. parapsilosis e C. glabrata. Conclui-se que são necessários estudos posteriores para desenvolvimento e validação de novos primers que mostrem maior sensibilidade e especificidade para as espécies patogênicas

Development of calcium alginate beads containing paclitaxel-loaded lipid-core nanocapsules intended for oral administration

We developed a solid formulation of calcium alginate beads containing paclitaxel-loaded lipid-core nanocapsules (PTX-LNC-Bead) intended for oral administration. The PTX-LNC liquid formulation was prepared by interfacial deposition and trapped into calcium alginate beads. These beads were characterized in terms of size, morphology, swelling rate, encapsulation efficiency, and release of PTX and LNC in simulated gastrointestinal fluids. Results showed that the beads were gastro-resistant with low swelling rate and drug release lower than 3.5% at pH 1.2 (2h). At pH 6.8, the beads showed high swelling rate and disintegration after 80 min. Drug release was 60% after 600 min. Particle sizing as a function of time confirmed that LNC were released intact from the beads at pH 6.8 showing that PTX-LNC-Bead is a promising product for PTX oral administration. Our results pave the way for novel formulations intended for drug targeting by the oral route

Desenvolvimento de primers para identificação e diferenciação de espécies de Candida em secreção vaginal por PCR em tempo real (qPCR)

Infecções fúngicas são cada vez mais frequentes, principalmente relacionadas ao sistema geniturinário e causadas por Candida spp. A PCR mostra-se promissora para o diagnóstico e para sua aplicação faz-se necessário o desenvolvimento de primers. Para isso obteve-se sequências da região ITS do rDNA 18S de 5 espécies de Candida, alinhou-se e verificou-se os tamanhos dos amplicons e as Tms teóricas. Cepas padrão e cepas cultivadas foram utilizadas como referência. Além disso, 67 amostras de DNA de secreção vaginal foram submetidas a qPCR e os resultados foram confirmados em gel de agarose 2%. Os testes in silico demonstraram a capacidade do par de primers em diferenciar as cinco espécies, o que foi confirmado após a amplificação das cepas padrão e de amostras de secreção vaginal, identificadas em 20 amostras. O limite de detecção foi de 58 células/mL para as cepas padrão de C. albicans e C. tropicalis e 29 células/mL para C. parapsilosis. A sensibilidade da qPCR frente ao teste de crescimento microbiológico foi de 68%, com especificidade de 90%. A técnica possui potencial de diagnóstico, porém precisa ser otimizada para testes quantitativos

AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE DO RIO PARDINHO UTILIZANDO O ENSAIO COMETA EM Astyanax fasciatus Cuvier, 1819

O Rio Pardinho é o principal recurso hídrico que abastece a cidade de Santa Cruz do Sul, além de drenar diversos municípios da região do Vale do Rio Pardo. Sofre influencia das atividades desenvolvidas às suas margens, o que resulta em impactos negativos na qualidade da água. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial genotóxico de quatro pontos amostrais ao longo do Rio Pardinho, da sua nascente a sua foz, (P1, P2, P3 e P4) em diferentes estações do ano utilizando o Ensaio Cometa com Astyanax fasciatus, peixe nativo da região. Em cada ponto foram coletados em média 12,3±3,7 peixes por estação do ano. Os resultados do Ensaio Cometa variaram conforme a estação, mas em geral o P4 apresentou os maiores valores de Índice de Dano (ID). Isso indica que em direção à foz do Rio Pardinho existe algum fator que influencia na qualidade da água do rio. Entretanto, o aumento da genotoxicidade ao longo do rio não foi linear, pois o P2 também apresentou alto valor de ID em todas as estações, exceto no outono. Dessa forma acredita-se que não só nos centros urbanos, mas na área rural também existam poluentes que chegam ao rio afetando a biota aquática

Nanoformulation shows cytotoxicity against glioblastoma cell lines and antiangiogenic activity in chicken chorioallantoic membrane

Glioblastoma (GB) is a histological and genetically heterogeneous brain tumor that is highly proliferative and vascularized. The prognosis is poor with currently available treatment. In this study, we evaluated the cytotoxicity and antiangiogenic activity of doxorubicin-loaded-chitosan-coated-arginylglycylaspartic acid-functionalized-poly(ε-caprolactone)-alpha bisabolol-LNC (AB-DOX-LNC-L-C-RGD). The nanoformulation was prepared by self-assembling followed by interfacial reactions, physicochemically characterized and evaluated in vitro against GB cell lines (U87MG and U138MG) and in vivo using the chicken chorioallantoic membrane assay (CAM). Spherical shape nanocapsules had a hydrodynamic mean diameter of 138 nm, zeta potential of +13.4 mV, doxorubicin encapsulation of 65%, and RGD conjugation of 92%. After 24 h of treatment (U87MG and U138MG), the median inhibition concentrations (IC50) were 520 and 490 nmol L−1 doxorubicin-equivalent concentrations, respectively. The treatment induced antiproliferative activity with S-phase cell-cycle arrest and apoptosis in the GB cells. Furthermore, after 48 h of exposure, evaluation of antiangiogenic activity (CAM) showed that the relative vessel growth following treatment with the nanocapsules was 5.4 times lower than that with the control treatment. The results support the therapeutic potential of the nanoformulation against GB and, thereby, pave the way for future preclinical studies

Encapsulation of lapatinib ditosylate in multi-wall nanocapsules functionalized with trastuzumab antibody : evaluation of anti-tumor activity

Primeiramente, o objetivo desta tese foi realizar um levantamento bibliográfico sobre as aplicações biológicas das nanocápsulas de núcleo lipídico. Essa pesquisa resultou na elaboração de um artigo de revisão que contempla detalhes importantes sobre fatores metodológicos que influenciam nas características físico-químicas das nanocápsulas de núcleo lipídico, sua estrutura supramolecular, estratégias de marcação fluorescente e modificação de superfície. Posteriormente, desenvolvemos nanocápsulas de núcleo lipídico multiparede contendo o fármaco ditosilato de lapatinibe e funcionalizadas com anticorpo trastuzumabe (LAP-LNC+-TRAS), ambos inibidores do receptor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico 2 (HER2). Além disso, avaliamos o seu potencial antitumoral in vitro, frente a linhagens de câncer de mama HER2 positivo. Isso porque, cerca de 20 a 30% dos cânceres de mama apresentam superexpressão HER2, os quais são caracterizados por serem invasivos e metastáticos. Nesse sentido, a formulação foi preparada por deposição interfacial de polímero pré-formado, seguido de revestimento com quitosana e complexação organometálica (utilizando Zn2+ como íon metálico) com trastuzumabe (LAP-LNC+-TRAS). A partir de um estudo de pré-formulação foi definida a concentração de anticorpo (200 μg mL-1) adequada para manter a estabilidade físico-química da partícula. Além disso, LAP-LNC+-TRAS apresentou formato esférico, com diâmetro médio <200 nm e baixa polidispersividade. O potencial zeta foi positivo, o teor de fármaco e a eficiência de encapsulação registrados foram próximos a 100%. A complexação do anticorpo à partícula foi verificada por cromatografia em papel. Modos vibracionais característicos das matérias-primas que compõem a formulação foram observados por FT-IR, além de alterações no entorno químico das partículas após a complexação com o anticorpo, demonstrando a interação do trastuzumabe com o sistema. In vitro, a formulação desenvolvida reduziu a viabilidade celular da linhagem SKBR3 (HER2 positivo). No ensaio de captação celular, a presença do anticorpo na superfície da partícula mostrou-se importante para o direcionamento e internalização do corante lipofílico incorporado às nanocápsulas. Embora a formulação desenvolvida tenha reduzido a viabilidade celular na linhagem HCC1954 (HER2 positiva, instrinsecamente resistente a inibidores de tirosina quinase) um efeito semelhante foi observado para formulações que não continham ditosilato de lapatinibe e trastuzumabe. O tratamento com LAP-LNC+-TRAS não alterou a expressão gênica de genes relacionados a morte celular por apoptose na linhagem HCC1954. Também verificamos que LAP-LNC+-TRAS é estável em fluidos gástrico e intestinal simulados, sendo que a presença do revestimento com quitosana foi importante para a manutenção do diâmetro de partícula. Esses achados abrem caminho para uma possível administração oral dessa partícula, além da via intravenosa. Em conclusão, demonstramos a viabilidade de obtenção da formulação LAP-LNC+-TRAS, ora inédita, e que apresenta a vantagem de combinar, em um mesmo nanocarreador, dois inibidores de HER2. Ademais, evidenciamos o potencial de LAP-LNC+-TRAS para o direcionamento ativo de fármacos e a sua ultização como uma possível estratégia para melhorar o tratamento do câncer de mama HER2 positivo. Consequentemente, esta partícula merece uma investigação mais aprofundada em novos estudos pré-clínicos.Firstly, the objective of this thesis was to conduct a comprehensive bibliographic survey about the biological applications of lipid-core nanocapsules. This research resulted in a review article that includes important details on methodological factors that influence the physicochemical characteristics of lipid-core nanocapsules, their supramolecular structure, fluorescent labeling strategies, and surface modification. Subsequently, we developed multiwall lipid-core nanocapsules containing the drug lapatinib ditosylate and functionalized with trastuzumab antibody (LAP-LNC+-TRAS), both inhibitors of epidermal growth factor 2 (HER2) receptor type 2. Additionally, we evaluated their antitumor potential in vitro against HER2-positive breast cancer cells. This is because about 20 to 30% of breast cancers overexpressed HER2 and are characterized by being invasive and metastatic. In this sense, the formulation was prepared by interfacial deposition of preformed polymer, followed by coating with chitosan and organometallic complexation (using Zn2+ as metallic ion) with trastuzumab (LAP-LNC+-TRAS). Based on a pre-formulation study, the concentration of antibody (200 μg mL-1) appropriated to maintain the physicochemical stability of the particle was defined. Furthermore, the LAP-LNC+-TRAS exhibited a spherical shape, with an average diameter <200 nm and low polydispersity. The zeta potential was positive, the drug content and encapsulation efficiency recorded were close to 100%. The complexation of the antibody to the particle surface was confirmed by paper chromatography. FT-IR analysis revealed vibrational modes characteristic of the formulation's raw materials, and changes in the chemical environment of the particles after antibody complexation demonstrated the interaction between trastuzumab and the system. In vitro, the developed formulation reduced the cell viability of the SKBR3, a HER2-positive cell line. The presence of the antibody on the particle surface proved to be crucial for targeting and internalizing the lipophilic dye incorporated into the nanocapsules, as observed in the cellular uptake assay. Although the developed formulation reduced cell viability in the HCC1954 cell line (HER2 positive and intrinsically resistant to tyrosine kinase inhibitors), a similar effect was observed for formulations not containing lapatinib ditosylate and trastuzumab. Furthermore, treatment with LAP-LNC+-TRAS did not alter gene expression of genes related to cell death to apoptosis (HCC1954 cell line). We also verified that LAP-LNC+-TRAS is stable in simulated gastric and intestinal fluids, and the presence of the chitosan coating was important for the maintenance of the particle diameter. These findings present the possibility of oral administration of this particle, besides to the intravenous route. In conclusion, we demonstrate the feasibility of obtaining the LAP-LNC+-TRAS formulation, an innovative nanocarrier that combines two HER2 inhibitors whitin the same nanocarrier. Moreover, we demonstrate the potential of LAP-LNC+-TRAS for active drug targeting, highlighting its potential as a strategy for improving the treatment of HER2-positive breast cancer. Consequently, this particle warrants further investigation in pre-clinical studies

Development of calcium alginate beads containing paclitaxel-loaded lipid-core nanocapsules intended for oral administration

We developed a solid formulation of calcium alginate beads containing paclitaxel-loaded lipid-core nanocapsules (PTX-LNC-Bead) intended for oral administration. The PTX-LNC liquid formulation was prepared by interfacial deposition and trapped into calcium alginate beads. These beads were characterized in terms of size, morphology, swelling rate, encapsulation efficiency, and release of PTX and LNC in simulated gastrointestinal fluids. Results showed that the beads were gastro-resistant with low swelling rate and drug release lower than 3.5% at pH 1.2 (2h). At pH 6.8, the beads showed high swelling rate and disintegration after 80 min. Drug release was 60% after 600 min. Particle sizing as a function of time confirmed that LNC were released intact from the beads at pH 6.8 showing that PTX-LNC-Bead is a promising product for PTX oral administration. Our results pave the way for novel formulations intended for drug targeting by the oral route