A két pórusdoménnal rendelkező, háttér K+ csatornák szabályozásának vizsgálata = Investigation of the regulation of two-pore-domain background K+ channels

Jelentősen előreléptünk a TRESK háttér kálium csatorna (Twik-Related Spinal cord K+ channel) szabályozásának megértésében. A régebben általunk közölt TRESK-calcineurin kapcsolódás után leírtuk a csatorna egy újabb közvetlen fehérje-fehérje interakcióját. A 14-3-3 adapter fehérje foszforiláció-függő módon kötődik a csatorna RSNSCP motívumához, és rendkívül összetett módon befolyásolja annak szabályozását. Míg a calcineurin kihorgonyzódása, majd a csatorna ezt követő defoszforilációja, a kalcium-függő aktivációért felelős, addig a 14-3-3 kétféle módon is meghatározza a csatorna visszatérését a nyugalmi (gátolt) állapotba. Kimutattuk, hogy a protein kináz A által foszforilált (14-3-3-kötő motívumban található) 264-es szerinhez kapcsolódó adapter fehérje gátolja a csatorna aktivitást. Emellett azonban a csatorna gátlásához egy másik régió (szerin 274, 276 és 279) foszforilációja is hozzájárul. Érdekes módon a 14-3-3 gátolni képes azt a ma még ismeretlen, protein kináz A-tól különböző kinázt, mely ez utóbbi régiót foszforilálja. Eredményeink megmutatták tehát, hogy két különböző gátló kináz útvonal konvergál a TRESK csatornára, és a két jelpályát a 14-3-3 jelentős mértékben és eltérő módon modulálja. Felismeréseink alapvetően befolyásolják azokat a kísérleti megközelítéseket, melyek a TRESK-et gátló kinázok pontosabb azonosítását célozzák, és rámutatnak a hátsó gyöki ganglion érző neuronjaiban nagy mennyiségben kifejeződő csatorna fiziológiás szabályozásának lehetőségeire. | We have significantly advanced in the understanding of the regulation of the background potassium channel, TRESK (Twik-Related Spinal cord K+ channel). In addition to TRESK-calcineurin binding, we have discovered a further direct protein-protein interaction of the channel. The adaptor protein, 14-3-3 binds to the RSNSCP motif in a phosphorylation-dependent manner, and influences channel regulation. Whereas the binding of calcineurin, and the subsequent dephosphorylation of the channel, is responsible for the calcium-dependent activation, 14-3-3 determines the return of channel activity to the resting (inhibited) state via two distinct pathways. We demonstrated that the docking of the adaptor protein to serine 264 inhibited channel activity, when this residue (located in the 14-3-3-binding motif) was phosphorylated by protein kinase A. The phosphorylation of another region (serine 274, 276 and 279) also contributes to channel inhibition. Interestingly, 14-3-3 inhibits a presently unknown kinase (different from protein kinase A) phosphorylating this region. Our results indicate that two distinct inhibitory kinase pathways converge on TRESK, and these two pathways are differentially modulated by 14-3-3. Our observations direct future experimental approaches, which aim the more precise identification of the kinases inhibiting TRESK, and also indicate possible physiological regulatory mechanisms of TRESK channels expressed abundantly in the sensory neurons of dorsal root ganglia

Új feszültségfüggő és 2P típusú kálium csatornák klónozása és szerepük vizsgálata = Cloning and functional characterisation of new voltage-dependent and 2P-type

Pályázatunkban feszültségfüggő- és 2P-típusú kálium csatornák klózását, valamint működésük vizsgálatát tűztük ki célul. Elsősorban szabályozásukkal valamint fizológiás szerepükkel foglalkoztunk. A 2P típusú TRESK csatornát másodikként klónoztuk meg, és elsőként írtuk le kalcium-függő szabályozását. Kimutattuk, hogy a TRESK-et ?a 2P háttér csatornák között egyedülálló módon- az intracelluláris kalcium koncentráció emelkedése aktiválja. E hatást egy foszfatáz, a kalcineurin közvetíti. A kalcineurin reverzibilisen defoszforilálja a TRESK csatorna intracelluláris hurok szakaszának 276-os foszfoszerinjét, aminek következtében a csatorna konduktanciája közel 10x-esére fokozódik. Felismertük, hogy a TRESK intracelluláris hurok részén egy olyan szekvencia motívum (PQIVID) van jelen, melyhez hasonló a kalcineurin legismertebb szubsztrátjában, az NFAT-ban is megtalálható. Kimutattuk, hogy a kalciummal aktivált kalcineurin e motívumon keresztül is kapcsolódik a TRESK-hez, ami előfeltétele a csatorna defoszforilációjának/aktiválásának. Vizsgálatainkban részletesen elemeztük a TRESK farmakológiai tulajdonságait, eredményeink alapján a TRESK áram egyrészt elkülönítő más 2P csatornákétól, másrészt megállapítható aktivációjának mértéke is. A Kv8.2 feszültségfüggő kálium csatorna klónozását követően kimutattuk, hogy az alegység elsősorban a retina fotoreceptoraiban expresszálódik, és jelenléte e sejtek számára különleges elektrofiziológiai tulajdonságot biztosít. | The aim of our OTKA project was to clone and characterize 2P-type and voltage dependent potassium channels. We have focused mainly on their regulation and physiological role. We published the second paper about the cloning of the 2P type TRESK channel and we described its calcium dependent regulation. We have shown that TRESK, unlike any other 2P-type potassium channel, is activated by elevation of the cytoplasmic Ca2+ concentration. This effect is mediated by the calcium dependent phosphatase, calcineurin. Calcineurin dephosphorylates phosphoserine 276 in the intracellular loop of TRESK what results in its increased conductance of almost 10-fold. We recognized an amino acid stretch in the intracellular loop of TRESK (PQIVID) which is similar to a motif possessed by the most important substrate of calcineurin, NFAT. We have shown that calcineurin, when activated by Ca2+, attaches to TRESK through this motif and this binding is necessary for the dephosphorylation/activation of the channel. We also analyzed the pharmacological properties of TRESK; based on these results TRESK current can be distinguished from that of other 2P potassium channels. In addition, the degree of the activation of TRESK can also be estimated. After we had cloned the Kv8.2 voltage sensitive potassium channel we showed that the subunit is expressed predominantly in the photoreceptors of the retina and its current significantly contributes to the unique electrophysiological properties of these cells

Formation of Functional Heterodimers by TREK-1 and TREK-2 Two-pore Domain Potassium Channel Subunits.

Two-pore domain (K2P) potassium channels are the major molecular correlates of the background (leak) K+ current in a wide variety of cell types. They generally play a key role in setting the resting membrane potential and regulate the response of excitable cells to various stimuli. K2P channels usually function as homodimers and only a few examples of heteromerization have been previously reported. Expression of the TREK (TWIK-related K+ channel) subfamily members of K2P channels often overlaps in neurons and in other excitable cells. Here we demonstrate that heterologous coexpression of TREK-1 and TREK-2 subunits results in the formation of functional heterodimers. Taking advantage of a tandem construct (in which the two different subunits were linked together to enforce heterodimerization) we characterized the biophysical and pharmacological properties of the TREK-1/TREK-2 current. The heteromer was inhibited by extracellular acidification and by spadin similarly to TREK-1, while its ruthenium red sensitivity was intermediate between TREK-1 and TREK-2 homodimers. The heterodimer has also been distinguished from the homodimers by its unique single channel conductance. Assembly of the two different subunits was confirmed by coimmunoprecipitation of epitope tagged TREK-1 and TREK-2 subunits, coexpressed in Xenopus oocytes. Formation of TREK-1/TREK-2 channels was also demonstrated in native dorsal root ganglion neurons indicating that heterodimerization may provide greater diversity of leak K+ conductances also in native tissues

Formation of functional heterodimers between the TASK-1 and TASK-3 two-pore domain potassium channel subunits

The potassium channels in the two-pore domain family are widely expressed and regulate the excitability of neurons and other excitable cells. These channels have been shown to function as dimers, but heteromerization between the various channel subunits has not yet been reported. Here we demonstrate that two members of the TASK subfamily of potassium channels, TASK-1 and TASK-3, can form functional heterodimers when expressed in Xenopus laevis oocytes. To recognize the two TASK channel types, we took advantage of the higher sensitivity of TASK-1 over TASK-3 to physiological pH changes and the discriminating sensitivity of TASK-3 to the cationic dye ruthenium red. These features were clearly observed when the channels were expressed individually. However, when TASK-1 and TASK-3 were expressed together, the resulting current showed intermediate pH sensitivity and ruthenium red insensitivity (characteristic of TASK-1), indicating the formation of TASK-1/TASK-3 heterodimers. Expression of a tandem construct in which TASK-3 and TASK-1 were linked together yielded currents with features very similar to those observed when coexpressing the two channels. The tandem construct also responded to AT(1A) angiotensin II receptor stimulation with an inhibition that was weaker than the inhibition of homodimeric TASK-1 and greater than that shown by TASK-3. Expression of epitope-tagged channels in mammalian cells showed their primary presence in the plasma membrane consistent with their function in this location. Heteromerization of two-pore domain potassium channels may provide a greater functional diversity and additional means by which they can be regulated in their native tissues

TRESK Background K+ Channel Is Inhibited by PAR-1/MARK Microtubule Affinity-Regulating Kinases in Xenopus Oocytes

TRESK (TWIK-related spinal cord K+ channel, KCNK18) is a major background K+ channel of sensory neurons. Dominant-negative mutation of TRESK is linked to familial migraine. This important two-pore domain K+ channel is uniquely activated by calcineurin. The calcium/calmodulin-dependent protein phosphatase directly binds to the channel and activates TRESK current several-fold in Xenopus oocytes and HEK293 cells. We have recently shown that the kinase, which is responsible for the basal inhibition of the K+ current, is sensitive to the adaptor protein 14-3-3. Therefore we have examined the effect of the 14-3-3-inhibited PAR-1/MARK, microtubule-associated-protein/microtubule affinity-regulating kinase on TRESK in the Xenopus oocyte expression system. MARK1, MARK2 and MARK3 accelerated the return of TRESK current to the resting state after the calcium-dependent activation. Several other serine-threonine kinase types, generally involved in the modulation of other ion channels, failed to influence TRESK current recovery. MARK2 phosphorylated the primary determinant of regulation, the cluster of three adjacent serine residues (S274, 276 and 279) in the intracellular loop of mouse TRESK. In contrast, serine 264, the 14-3-3-binding site of TRESK, was not phosphorylated by the kinase. Thus MARK2 selectively inhibits TRESK activity via the S274/276/279 cluster, but does not affect the direct recruitment of 14-3-3 to the channel. TRESK is the first example of an ion channel phosphorylated by the dynamically membrane-localized MARK kinases, also known as general determinants of cellular polarity. These results raise the possibility that microtubule dynamics is coupled to the regulation of excitability in the neurons, which express TRESK background potassium channel

Klinikai - immunológiai vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben = Clinical-epidemiological studies in systemic autoimmune diseases

Klinikai - immunológiai vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben Czirják László A populációs alapú vizsgálatainkat lezártuk, és a szisztémás sclerosis, Raynaud jelenség illetve rheumatoid arthritis prevalencia értékeit publikáltuk. A michrochimérismus vizsgálataink nem zárultak interpretálható eredményekkel. Megjegyzendő, hogy más nemzetközi munkacsoportoknak is problámát okozott a kimutathatósági határon levő vizsgálat reprodukálható elvégzése. Az indukált köpet vizsgálat nem bizonyult reprodukálhatónak. Más, alternatív módszert (surfactans D, KL-6) használunk a tüdőmanifesztáció vizsgálatára illetve követésére. Alapmunkánkat közlésre elfogadták, követéses vizsgálatunk publikálása folyamatban van. A hosszutávú követéses vizsgálataink eredményeit szisztémás sclerosisban publikáltuk, kimutattuk, hogy rossz prognozissal jár a papaneopláziás szindróma formájában jelentkező systemás sclerosis. Emellett kidolgoztunk és validáltunk egy a bőrfolyamat aktivitását mérő beteg önkitöltő kérdőívet. Az aktivitás vizsgálatához szükséges kérdőíveket (scleroderma-HAQ, DASH) magyar nyelven validáltuk. Az európai scleroderma aktivitási kritériumok validálása és egy új aktivitási kritériumrendszer kialakítása folyamatban van, már rendelkezésre áll egy igen nagyszámú betegből álló egyéves követéses vizsgálat adatsora (1. sz. melléklet). Gyulladásos izombetegségekben a prógnózist vizsgáló munkánat szintén lezártuk. | Clinical epidemiological studies on systemic autoimmune diseases We have finished our population-based studies on the prevalence of connective tissue diseases. With regard to rheumatoid arthritis, Raynaud?s phenomenon and systemic sclerosis we have published our results. Investigation of microchimesism in systemic sclerosis did not give conclusive results, we had detectability problems with this particular method, similar to other groups . The induced sputum investigations did not show reproducible results therefore we worked out other alternative methods for the evaluation of interstitial lung involvement in connective tissue diseases. Detection of surfactant D and KL-6 markers are good surrogate markers for the severity of lung disease. Our long term follow up studies on systemic sclerosis indicated that the presence of paraneoplastic syndrome and gastric antral ectasia (watermelon stomach) are poor prognostic signs besides the well known organ manifestations in systemic sclerosis. We worked out and validated a patient self assessment questionnaire measuring the skin thickness of scleroderma patients. We have also completed our clinical epidemiological studies on inflammatory myopathies. The presence of cancer associated myositis caused a poor prognosis. Conversely, interstitial lung disease did not cause an unfavourable prognosis in our cohort

Szisztémás autoimmun betegségek pulmonális érintettségének klinikai és laboratóriumi vizsgálata = Clinical and laboratory investigation of the pulmonary manifestation of systemic autoimmune diseases

Systemás sclerosis (SSc) tüdőérintettsége alapvető hatású a betegség kimenetelére. Szérumban is mérhető anyagok - mint pl. a KL-6 - jelentőségét vizsgáltuk a PF-ra nézve. A KL-6 PF-ra vonatkoztatott szenzitivitása emelkedő értéket mutatott a PF súlyosságának fokozódásával. Sok olyan beteg is volt, akinél a PF ellenére normál KL-6 szintet mértünk, azaz a szérummarkerek nem helyettesítik a konvencionális módszereket. Prospektív vizsgálatunk elején mért KL-6 szintek szignifikánsan magasabbak voltak azokban, akik később elhunytak, mint akik életben maradtak. A követés során mért KL-6 változás nem jelezte a PF súlyosságában bekövetkezett változásokat. A módosított Rodnan-féle bőrpontszámot tartják a legalkalmazhatóbb vizsgálati módszernek a bőrérintettség vizsgálatára. Alternatív módszer kifejlesztése fontos. Az általunk kialakított önkitöltős betegkérdőív validálhatóan alkalmasnak bizonyult a bőrfolyamat megítélésére. Az ún. European Scleroderma Study Group aktivitási index kellően jó validitásúnak mutatkozott vizsgálatunkban, azonban nem tükrözte megfelelően a tüdőérintettség állapotát. Egy új 12 pontos aktivitási indexet alakítottunk ki (a FVC/DLCO, DLCO-változás, bőrfekély-változás, a HAQ-DI és az új önkitöltős bőrpontszám hozzáadásával). Az új index szorosabb összefüggést mutatott a tüdőfolyamattal, mint az eredeti. Különböző biomarkerek, mint pl. a KL-6 hozzáadása az új indexhez azonban nem javította az index használhatóságát. | Lung involvement plays an important role in the outcome of systemic sclerosis (SSc). We investigated the notability of distinct serum markers, such as KL-6 in characterization of lung involvement. The sensitivity of KL-6 for pulmonary fibrosis (PF) is increased with the severity of PF. Significant number of patients with PF had normal level of these markers; therefore we conclude that the use of these markers can not replace the conventional techniques. In our prospective study, we measured significantly higher initial serum levels of KL-6 in patients who died than in survivors. However, any change of serum level of KL-6 during the follow up not predicts the alteration of severity of PF. The modified Rodnan skin score (mRSS) is considered the most appropriate technique for measuring skin involvement. There is a need for an alternative method. We established and validated a patient self assessment questionnaire for the evaluation of skin thickening in SSc. The validity of the European Scleroderma Study Group (EScSG) activity index is good, though the lung-related disease activity may not be sufficiently represented. We constructed a 12 point activity index (by adding the FVC/DLCO, change in DLCO, change in the ulcer scores, HAQ-DI and our new patient reported skin score), which showed closer correlation with lung involvement. Biomarkers - including KL-6 - were related to both the EScSG and the 12 point index, though they did not improve the total variance of the model

Immune Profile Predicts Survival and Reflects Senescence in a Small, Long- Lived Mammal, the Greater Sac-Winged Bat (Saccopteryx bilineata)

The immune system imposes costs that may have to be traded against investment of resources in other costly life-history traits. Yet, it is unknown if a trade-off between immunity and longevity occurs in free-ranging mammals. Here, we tested if age and survival, two aspects associated with longevity, are linked to immune parameters in an 8 g bat species. Using a combination of cross-sectional and longitudinal data, we assessed whether total white blood cell (WBC) counts, bacterial killing ability of the plasma (BKA) and immunoglobulin G (IgG) concentration change with age. Furthermore, we asked if these immune parameters impose costs resulting in decreased survival probabilities. We found that WBC counts decreased with age both within and among individuals. IgG concentrations were higher in older individuals, but did not change with age within individuals. Furthermore, individuals with above average WBC counts or IgG concentration had lower probabilities to survive the next six months. High WBC counts and IgG concentrations may reflect infections with parasites and pathogens, however, individuals that were infected with trypanosomes or nematodes showed neither higher WBC counts or IgG concentrations, nor was infection connected with survival rates. BKA was higher in infected compared with uninfected bats, but not related to age or survival. In conclusion, cellular (WBC) and humoral (IgG) parts of the immune system were both connected to age and survival, but not to parasite infections, which supports the hypothesis that energetically costly immunological defences are traded against other costly life-history traits, leading to a reduced lifespan in this free-ranging mammal

A szeronegatív spondylarthritisek és a szisztémás kötőszöveti betegségek gastrointestinalis vonatkozásai = Gastrointestinal involvement of spondylarthropathies and systemic connective tissue disorders

A szisztémás autoimmun betegségek gyomor-bélrendszeri érintettségére vonatkozóan 3 kiemelt területen végeztünk kutatásokat: (1.) kísérletes állatmodellben a gastrointestinum különböző funkcióinak regulációjában részt vevő citokinek és neuropeptidek szerepe, (2.) a szeronegatív spondylarthritisek kialakulásában szerepet játszó genetikai jellegzetességek és (3.) a kötőszöveti betegségek (primer Sjögren szindróma és szisztémás sclerosis) gasztrointesztinális manifesztációinak vizsgálata Eredmények: (1.) Az interferon-α, amely egy hatékony antivirális és tumorellenes citokin, mind intravenásan, mind intracysternálisan adva csökkenti a gyomorszekréciót. A gyomorszekréciót gátló hatás kialakulása nitrogén monoxid felszabadulásán keresztül történik, és a központi idegrendszeri CRF ( 2-es típusú) receptort is magába foglalja. (2.) Crohn betegségben a CARD15/NOD2 intracelluláris receptor fehérjék polimorfizmusánakvizsgálata során azt találtuk, hogy a betegek 33.78 %ában van jelen a NOD2/CARD15 mutációja a control populációban észlelt 16.23 %-hoz képest. Arthropathia psoriaticaban szenvedő betegeknél ezeknek a géneknek a polymorphismusa nem játszik szerepet. (3.) Primer Sjögren szindrómában a májenzimek a beteget 20%-ában mutattak eltérés, 8 %-a autoimmun májbetegséghez kapcsolódik. A májenzim eltérésben szenvedő betegeknél a betegség korábbi életkorban jelentkezik, és gyakrabban van polyarthritisük. | Connective tisue diseases involve gastrointestinal tract. The major aims of our investigations were: (1.) examination of the role of different cytokines and neuropeptides in thr regulation of different functions of the gastrointestinal tract, (2.) genetic predisposition of and the role of mucosal integrity of seronegative spondylarthropathies, and (3.) gastrointestinal manifestations of connective tissuse diseases: liver involvement of primary Sjögren?s syndrome and disturbed gastrointestinal motility of systemic sclerosis. Results: (1.) Interferon-?, a potent antiviral and antitumor cytokine given intravenously and intracisternally decreases gastric secretion. The inhibition of gastric secretion involves nitrogen monoxide and central CRF type-2 receptors. (2.) CARD/15NOD2 polymorphism is present in 33.78 % of patient suffernig from Crohn?s disease. The presence of psoriatic arthritis is not associated with polkymorphism of CARD15/NOD2 proteins. (3.) Primary Sjögren?s syndrome is accompanied by elevation of liver enzymes in 20 % of patients. 8% of liver enzyme disturbences is duo to autoimmune liever diseases: autoimmune hepatitis or primary biliary cirrhosis. Patients having elevated liver enzymes show an early onset of disease and have polyarthritis much frequently in comparison with those having normal liver enzymes

Biokémiai markerek jelentősége a neuroendokrin daganatok felismeresében és a betegek követésében

Circulating markers of neuroendocrine tumours are useful tools in the diagnosis of these tumours. Laboratory tests for general biomarkers have acceptable sensitivity for the recognition of neuroendocrine tumours as these biologically active proteins are typically synthesized by all types of neuroendocrine cells. Measurement of chromogranin A is widely used not only in the diagnosis of neuroendocrine tumours but it may predict the prognosis of the diseases and the effect of the antitumor therapy. It is also a useful tool for the detection of residual tumours. Neurendocrine tumours represent a heterogeneous group of tumours with the ability to secrete several hormones and, therefore, measurement of these hormones can also serve as neuroendocrine cell type-specific markers in routine clinical practice. In this review the authors summarize the significance of tumour markers in the diagnosis of neuroendocrine tumours as well as in the management and follow-up of patients with this disease. Orv. Hetil., 2014, 155(45), 1775-1782