Fracionamento da peçonha da serpente Bothrops alternatus e determinação de suas atividades biológicas e enzimáticas

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)As serpentes pertencentes ao gênero Bothrops são encontradas em todo o território nacional, sendo responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos notiticados anualmente ao Ministério da Saúde. Os acidentes provocados por serpentes botrópicas caracterizam-se por efeitos locais e sistêmicos. A maioria das toxinas responsáveis por estes efeitos são enzimas que podem apresentar atividades proteolítica, hemorrágica, fosfolipásica A2, dentre outras. O presente trabalho teve como objetivo o fracionamento da peçonha bruta de Bothrops alternatus e delineamento das atividades proteolítica, hemorrágica e fosfolipásica A2 das frações obtidas. A peçonha bruta de B. alternatus foi submetida a uma única etapa cromatográfica utilizando-se as seguintes resinas de troca iônica : 1º - CM Sephadex C-25 (50 mg de peçonha bruta-PB, tampão acetato de amônio, 0.05 M, pH 5,0); 2º —DEAE Sephadex A—25 (100 mg de PB, tampão bicarbonato de amônio (AMBlC), 0,05M, pH 7,8); e 3º -DEAE Sephacel (200 mg de PB, tampão AMBIC,0,05 M, pH7,8). O primeiro fracionamento resultou em apenas um pico principal, com uma recuperação protéica final de somente 14,61%. No segundo e terceiro fracionamentos foram obtidas 8 frações, designadas de 01 a 08 e A1 a A8, com recuperação protéica de 26,5% e 50,31%, respectivamente. A atividade proteolítica foi realizada, utilizando o tibrinogênio bovino e a caseína como substratos. Nos dois últimos fracionamentos todas as frações obtidas apresentaram atividade proteolítica sobre o fibrinogênio bovino, exceto A7 e A8. A atividade caseinolítica também foi encontrada na maioria das frações, exceto em D7, A7 e A8. A presença de toxinas hemorrágicas foi verificada, por meio da inoculação subcutânea das amostras, no dorso de camundongos machos. Esta atividade foi evidenciada nas frações D4, D5, D7, A3, A4 e A7,onde as frações D5, D7 e A7 apresentaram halos hemorrágicos mais evidentes. A atividade PLAg foi determinada por titulação potenciométrica, utilizando como substrato emulsão aquosa de gema de ovo. A atividade PLAZ foi encontrada apenas na PB , estando ausente em todas as frações isoladas. Não foi realizada nenhuma atividade para as frações obtidas a partir do fracionamento com a resina CM Sephadex C-25. Os resultados obtidos neste trabalho nos permitiram verificar que a resina DEAE Sephacel é mais eficiente para separar os componentes da PB de B. alternatus. Também foi evidenciado que a PB de B. alternatus é muito rica em enzimas proteolíticas. No entanto, os fatores responsáveis pela ausência da atividade fosfolipásica A; não foram determinados, sendo necessário novos estudos visando a identificação das fosfolipases A2 ativas presentes na peçonha desta serpente

Mechanisms of Vascular Damage by Hemorrhagic Snake Venom Metalloproteinases: Tissue Distribution and In Situ Hydrolysis

Snakebite accidents by vipers cause a massive disturbance in hemostasis and tissue damage at the snakebite area. The systemic effects are often prevented by antivenom therapy. However, the local symptoms are not neutralized by antivenoms and are related to the temporary or permanent disability observed in many patients. Although the mechanisms involved in coagulation or necrotic disturbances induced by snake venoms are well known, the disruption of capillary vessels by SVMPs leading to hemorrhage and consequent local tissue damage is not fully understood. In our study, we reveal the mechanisms involved in hemorrhage induced by SVMPs by comparing the action of high and low hemorrhagic toxins isolated from Bothrops venoms, in mouse skin. We show remarkable differences in the tissue distribution and hydrolysis of collagen within the hemorrhagic lesions induced by high and low hemorrhagic metalloproteinases. According to our data, tissue accumulation of hemorrhagic toxins near blood vessel walls allowing the hydrolysis of basement membrane components, preferably collagen IV. These observations unveil new mechanistic insights supporting the local administration of metalloproteinases inhibitors as an alternative to improve snakebite treatment besides antivenom therapy

Sophorolipids: A review on production and perspectives of application in agriculture

Sophorolipids are bioactive molecules that have gained a lot of attention in the recent decades due to their unique functional properties of reducing surface and interfacial tension, emulsification and solubilization. They are mainly produced by the yeast Candida bombicola and are composed of a sugar moiety linked to a fatty acid chain. Sophorolipids are non-toxic, highly efficient and stable at extreme conditions and possess environmentally friendly characteristics over the chemical surfactants. This review is focused on the main characteristics of sophorolipids, fermentation processes, and their utilization in the agricultural field. In this context, sophorolipids are very suitable for use in agriculture, as enhancers of solubility and mobility of plant nutrients, which could result in increased plant biomass, root size and fruit yield. In addition, they could be used for biodegradation of oils, bioremediation of heavy metals in contaminated soils, and as potential biopesticides, to control phytopathogenic microorganisms in agriculture. The extensive use of chemical pesticides has led to widespread insecticide resistance and to hazards to human health and the environment due to their high toxicity. Thus, the introduction of a new biomolecule to control plant diseases and increase crop yield has become an interesting alternative. As a result of the demonstrated antimicrobial activity towards phytopathogenic bacteria and fungi, sophorolipids could be extensively explored in the agriculture field, as a sustainable and natural multifunctional agent for plant crops and soils

Biomedical Potential of Hyaluronic Acid from Streptococcus zooepidemicus Produced in Sugarcane Molasses / Potencial Biomédico do Ácido Hialurônico do Streptococcus zooepidemicus Produzido no Melaço de Cana de Açúcar

Hyaluronic acid is a polymer with many biomedical applications with high production costs if obtained by fermentation. However, the use of agroindustry byproducts can improve the commercial viability. The aims of this work were to optimize the production of hyaluronic acid by Streptococcus zooepidemicus in sugarcane molasses medium supplemented with nutrients and to analyze the antioxidant and antimicrobial properties of hyaluronic acid. Hyaluronic acid production was greater in molasses (0.710 g·L-1) than in glucose (0.469 g·L-1). Only glutamine exhibited positive effects on production (0.843 g·L-1) in Erlenmeyer flasks. Using a bioreactor under 100 rpm agitation, production was three times greater than in flasks (2.55 g·L-1) and no differences were observed at higher agitation rates of 300 rpm. Hyaluronic acid produced presented with approximately 40 % (1 g·L-1) of antioxidant activity but did not show antimicrobial activity. Hyaluronic acid produced in molasses could be used in formulations as an antioxidant

Aplicação de soforolipídios produzidos por Starmerella bombicola em filmes ativos para revestimento de morangos / Application of sophorolipids produced by Starmerella bombicola in active films for strawberries coating

O morango é uma fruta muito suscetível à infecções por patógenos, o que reduz sua qualidade nutricional e tempo de prateleira. Uma alternativa para aumentar o prazo de validade dos morangos é a utilização de tecnologias usando filmes comestíveis incorporados à compostos antimicrobianos, como os soforolipídios. O objetivo deste trabalho foi produzir soforolipídios por Starmerella bombicola e incorporar em filmes de amido de mandioca, visando a redução da contaminação microbiana e aumento de tempo de validade do morango. As fermentações resultaram na produção de 7,6 g/L de soforolipídios, que foram utilizados para as formulações dos biofilmes. A formulação 1 continha apenas amido, a formulação 2 foi composta de amido acrescido de 5% de soforolipídios e formulação 3 continha amido e 10% de soforolipídios. Após 20 dias, nas frutas controle não revestidas foi observado 11,84% de perda de massa, enquanto que nas frutas revestidas somente com o amido a perda foi de 9,28%. Em morangos tratados com amido acrescido de soforolipídios na concentração de 10% e 5%, observou-se 8,47 e 7,12% de perda de massa, respectivamente. Em relação à severidade de contaminação, as frutas controle apresentaram o índice de 75%, enquanto que em frutas tratadas com amido acrescido de soforolipídios observou-se uma drástica redução da severidade de contaminação (25%) para as duas concentrações testadas. A porcentagem de eficácia dos revestimentos do tratamento com amido e com amido acrescido de soforolipídios (5 e 10%) foi de 25% e 66,6%, respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo mostraram pela primeira vez na literatura o potencial uso de soforolípidios produzidos por S. bombicola como agentes de revestimentos de morangos agregando importantes propriedades às formulações poliméricas. 

Mechanisms involved in the hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases.

Com o objetivo de estudar as diferenças de potencial hemorrágico entre metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs), compararamos a ação da jararagina, toxina hemorrágica da classe P-III, e da BnP1, SVMP da classe P-I fracamente hemorrágica, quanto à ação em proteínas de matriz extracelular (MEC), células endoteliais e distribuição na MEC e endotélio. Nos ensaios de ligação em fase sólida, apenas a jararagina e a jarararagina-C (domínios tipo disintegrina e rico em cisteínas) se ligaram ao colágeno I e IV. Em HUVECs, a jararagina e BnP1 induziram apoptose, mas em modelo de pele, apenas a jararagina induziu intensa hemorragia, acompanhada de degradação do colágeno fibrilar e colágeno IV na região da hipoderme. A jararagina e jararagina-C localizaram-se na parede dos capilares sangüíneos co-localizando-se como o colágeno IV. Esses resultados sugerem que a ligação ao colágeno é importante para a hemorragia induzida pelas SVMPs da classe P-III, promovendo seu acúmulo nas proximidades dos vasos sanguíneos tornando a catalise dos componentes da MEC mais eficiente.In order to enlighten the mechanisms of hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases (SVMPs), the effects of jararhagin, a highly hemorrhagic P-III SVMP and BnP1, a weakly hemorrhagic P-I SVMP, on extracellular matrix (ECM) proteins, endothelial cells, and distribution in MEC and endothelium, was compared. In solid phase assay, only jararhagin and jararhagin-C (disintegrin-like and cysteine-rich domains) bond to collagen I and IV. In HUVECs, jararhagin and BnP1 induced apoptosis, but in skin model only jararhagin induced intense hemorrhage with degradation of the fibrillar collagen and collagen I, in hypodermis region. Jararhagin and jararhagin-C concentrated in blood vessels walls, co-localizing with collagen IV. These results suggest that the collagen binding is important to hemorrhage induced by P-III SVMPs, promoting their accumulation near to the blood vessels, making the catalysis of the basement membrane components more efficient

Fracionamento da peçonha da serpente Bothrops alternatus e determinação de suas atividades biológicas e enzimáticas.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisTrabalho de Conclusão de Curso (Graduação)As serpentes pertencentes ao gênero Bothrops são encontradas em todo o território nacional, sendo responsáveis pela maioria dos acidentes ofidicos notificados anualmente ao Ministério da Saúde. Os acidentes provocados por serpentes botrópicas caracterizam-se por efeitos locais e sistêmicos. A maioria das toxinas responsáveis por estes efeitos são enzimas que podem apresentar atividades proteolitica, hemorrágica, fosfolipásica A2, dentre outras. O presente trabalho teve como objetivo o fracionamento da peçonha bruta de Bothrops alternatus e delineamento das atividades proteolítica, hemorrágica e fosfolipásica A2 das frações obtidas. A peçonha bruta de B. alternatus foi submetida a uma única etapa cromatográfica utilizando-se as seguintes resinas de troca iônica : - CM Sephadex C-25 (50 mg de peçonha bruta-PB, tampão acetato de amônia, 0.05 M, pH 5,0); 2° -DEAE Sephadex A-25 (100 mg de PB, tampão bicarbonato de amônio (AMBIC), 0,05M, pH 7,8); e 3° -DEAE Sephacel (200 mg de PB, tampão AMBIC,0,05 M, pH7,8). O primeiro fracionamento resultou em apenas um pico principal, com uma recuperação protéica final de somente 14,61%. No segundo e terceiro fracionamentos foram obtidas 8 frações, designadas de D1 a D8 e Al a A8, com recuperação protéica de 26,5% e 50,31%, respectivamente. A atividade proteolitica foi realizada, utilizando o fibrinogênio bovino e a caseína como substratos. Nos dois últimos fracionamentos todas as frações obtidas apresentaram atividade proteolítica sobre o fibrinogênio bovino, exceto A7 e A8. A atividade caseinolitica também foi encontrada na maioria das frações, exceto em D7, A7 e A8. A presença de toxinas hemorrágicas foi verificada, por meio da inoculação subcutânea das amostras, no dorso de camundongos machos. Esta atividade foi evidenciada nas frações D4, D5, D7, A3, A4 e A7,onde as frações D5, D7 e A7 apresentaram halos hemorrágicos mais evidentes. A atividade PLA2 foi determinada por titulação potenciométrica, utilizando como substrato emulsão aquosa de gema de ovo. A atividade PLA2 foi encontrada apenas na PB , estando ausente em todas as frações isoladas. Não foi realizada nenhuma atividade para as frações obtidas a partir do fracionamento com a resina CM Sephadex C-25. Os resultados obtidos neste trabalho nos permitiram verificar que a resina DEAE Sephacel é mais eficiente para separar os componentes da PB de B. alternatus. Também foi evidenciado que a PB de B. alternatus é muito rica em enzimas proteolíticas. No entanto, os fatores responsáveis pela ausência da atividade fosfolipásica A2 não foram determinados, sendo necessário novos estudos visando a identificação das fosfolipases A2 ativas presentes na peçonha desta serpente

Mechanisms involved in the hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases.

Com o objetivo de estudar as diferenças de potencial hemorrágico entre metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs), compararamos a ação da jararagina, toxina hemorrágica da classe P-III, e da BnP1, SVMP da classe P-I fracamente hemorrágica, quanto à ação em proteínas de matriz extracelular (MEC), células endoteliais e distribuição na MEC e endotélio. Nos ensaios de ligação em fase sólida, apenas a jararagina e a jarararagina-C (domínios tipo disintegrina e rico em cisteínas) se ligaram ao colágeno I e IV. Em HUVECs, a jararagina e BnP1 induziram apoptose, mas em modelo de pele, apenas a jararagina induziu intensa hemorragia, acompanhada de degradação do colágeno fibrilar e colágeno IV na região da hipoderme. A jararagina e jararagina-C localizaram-se na parede dos capilares sangüíneos co-localizando-se como o colágeno IV. Esses resultados sugerem que a ligação ao colágeno é importante para a hemorragia induzida pelas SVMPs da classe P-III, promovendo seu acúmulo nas proximidades dos vasos sanguíneos tornando a catalise dos componentes da MEC mais eficiente.In order to enlighten the mechanisms of hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases (SVMPs), the effects of jararhagin, a highly hemorrhagic P-III SVMP and BnP1, a weakly hemorrhagic P-I SVMP, on extracellular matrix (ECM) proteins, endothelial cells, and distribution in MEC and endothelium, was compared. In solid phase assay, only jararhagin and jararhagin-C (disintegrin-like and cysteine-rich domains) bond to collagen I and IV. In HUVECs, jararhagin and BnP1 induced apoptosis, but in skin model only jararhagin induced intense hemorrhage with degradation of the fibrillar collagen and collagen I, in hypodermis region. Jararhagin and jararhagin-C concentrated in blood vessels walls, co-localizing with collagen IV. These results suggest that the collagen binding is important to hemorrhage induced by P-III SVMPs, promoting their accumulation near to the blood vessels, making the catalysis of the basement membrane components more efficient

Levan And Levansucrase-A Mini Review

Abstract: Levansucrase is a fructosyltranferase that synthesizes levan and present great biotechnological interest. It's being widely used in therapeutic, food, cosmetic and pharmaceutical industries. Levansucrase is produced by many microorganisms such as the Bacillus subtilis Natto using the sucrose fermentation. In this mini-review we described some properties and functions of this important group of enzymes and the recent technologies used in the production and purification of levansucrase and levan