Towards the identification of biomarkers for cystic fibrosis by proteomics

The scope of the work presented in this thesis is to provide identification and characterization of proteins that might contribute to the development and/or progression of the pulmonary disease Cystic Fibrosis (CF), aiming to a better understanding on the proteinaceous environment in several biological samples with influence in the disease. The objectives of this work were in accordance with the actual and to-date Portuguese National Health Plan and were developed in the National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge in Lisbon, Portugal, in collaboration with the University of Pittsburgh Medical Centre and the National Cancer Institute at Frederick, both in the United States of America. The involvement of such institutions recalls the importance of this study in trying to unravel mechanisms underlying the development and/or progression of this treatable but incurable disease. This thesis is divided in six chapters which contain results already published or under final preparation for submission to peer reviewed scientific journals of the area, according to point 1 of Artigo 41 from Capítulo V of Regulamento de Estudos Pós- Graduados da Universidade de Lisboa, published in Diário da República, 2ª Série - Nº 209 de 30 de Outubro de 2006. In this context, I hereby state that all the experiments, results and interpretation contained here are original and performed by myself with the collaboration of others where mentioned. The Chapter I corresponds to the General Introduction, where several aspects of the CF’s pathology are approached, since its recognition as an independent disease to the several CF-causing mutations and the phenotype evidenced by the patients. The contribution of several others molecular determinants other than the CFTR alone and the role of Proteomics in these achievements is also described. xxv iii Experimental design, methodologies, results and interpretation are provided in chapters II to V, each one dedicated to a different type of biological sample. Chapter II devotes it to the proteomics characterization of human serum by complementary approaches and integration of the identified species into networks and pathways with biological significance in the context of CF. Chapter III describes the characterization of the CF-associated proteome of mRBC and aims to interpreter previous phenomena reported in these cells of CF patients by the study of altered abundances levels of some relevant proteins. Chapter IV provides a wide molecular portrait of proteins being expressed in the nasal epithelial cells ultimately demonstrating the usefulness of this easily collectable biological sample in mimicking lungs’ microenvironment and its application to the study of respiratory diseases. Chapter V makes use of the deep proteome profiling of nasal epithelial cells and establish correlations and consequences for the impaired respiratory function observed in CF patients. Finally, a General Discussion is presented in Chapter VI were the main conclusions and remarks are pointed hoping to unveil new perspectives on CF while open novel questions to be answered by Proteomics.A Fibrose Quística (FQ) é a doença monogénica autossómica recessiva mais frequente e letal na população caucasiana, com uma incidência de 1 em cada 2500-3200 recém-nascidos sendo que 1 em cada 25-30 indivíduos apresentam pelo menos uma mutação no gene responsável pela patologia. Esta doença é causada por mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) que codifica para uma proteína com o mesmo nome e cuja principal função é servir de canal de cloreto regulado pelo cAMP (do Inglês, cyclic Adenosine Monophosphate) e cujos ciclos de abertura e fecho dependem do ATP (do Inglês, Adenosine Triphosphate) na membrana apical das células epiteliais. Actualmente, conhecem-se mais de 1800 mutações no gene da CFTR mas a delecção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 da cadeia polipéptídica (F508del; F508) constitui cerca de 70% dos cromossomas FQ analisados e está presente em cerca de 90% dos doentes de FQ, originando um produto com problemas ao nível da maturação e, consequentemente, disfuncional. Defeitos na síntese, estrutura, processamento e/ou função da CFTR ditam uma multiplicidade de sintomas observados nestes doentes: elevadas concentrações de cloreto e sódio no suor, insuficiência pancreática, disfunção intestinal e hepática, infertilidade e obstrução das vias respiratórias por um muco espesso e desidratado, criando as condições propícias ao desenvolvimento de infecções respiratórias crónicas e um estado de inflamação constante. De facto, a maior parte dos doentes FQ vê a sua qualidade de vida significativamente diminuída pela deterioração progressiva da função pulmonar que, em última instância, conduz à morte. Vários estudos têm sido efectuados no sentido de estabelecer uma relação entre o genótipo apresentado pelos doentes FQ e as manifestações clínicas da doença, tarefa dificultada pela heterogeneidade de mutações e sintomas apresentados pelos doentes bem como pela influência que o ambiente e outros factores celulares (denominados de genes modificadores da FQ) exercem. Dessa forma, importa conhecer que entidades celulares são estas cuja expressão e função poderão influenciar o desenvolvimento e/ou progressão da FQ, podendo mesmo constituir alvos terapêuticos da doença. Uns dos candidatos óbvios a este lugar são as proteínas. O seu estudo através das várias metodologias disponibilizadas pela Proteómica tem permitido um grande avanço na caracterização e conhecimento dos mecanismos envolvidos no processamento da CFTR; importa agora conhecer e investigar todo o ambiente proteico que contribui para o desenvolvimento e progressão da patologia. xxx O trabalho apresentado nesta tese surge como uma continuação da investigação que tem vindo a ser desenvolvida no Laboratório de Proteómica do Departamento de Genética do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge que se iniciou com o estudo dos mecanismos envolvidos no processamento e maturação da CFTR em linhas celulares, seguindo depois para um modelo animal tentando identificar proteínas diferencialmente expressas em pulmão e sua relevância para o desenvolvimento da doença pulmonar até ao estudo de amostras biológicas humanas no sentido de melhor caracterizar e compreender outras proteínas que não apenas a CFTR cujas alterações nos seus níveis de expressão poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos da patologia. Neste trabalho, foram analisados soro, membranas de eritrócitos e células do epitélio nasal de doentes de FQ em comparação com indivíduos saudáveis portadores ou não de uma mutação no gene CFTR, através de várias metodologias tecnológicas da Proteómica. Os objectivos foram atingidos com recurso a tecnologias existentes no Laboratório de Proteómica em Lisboa, como por exemplo a separação de proteínas por 2-DE (do Inglês, Two-Dimensional Electrophoresis) e sua identificação por MS (do Inglês, Mass Spectrometry), mais propriamente por MALDI-TOF/TOF (do Inglês, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-tandem Time of Flight) em colaboração com outros laboratórios nos EUA (Clinical Proteomics Facility, University of Pittsburgh Medical Centre, Pennsylvania e Laboratory of Proteomics and Analytical Technologies, National Cancer Institute at Frederick, Maryland) que nos permitiram fazer uso de tecnologias de ponta tanto na separação robusta como na identificação confiante de proteínas por MudPIT (do Inglês, Multidimension Protein Identification Technology). No capítulo II, são apresentadas e discutidas as funções de proteínas diferencialmente expressas que poderão ter implicações para a doença no soro dos vários grupos de indivíduos estudados. A razão deste estudo prende-se com o elevado potencial do soro para a identificação de biomarcadores por conter um elevado número de proteínas provenientes de todos os órgãos do organismo, ser de fácil colheita e constituir uma amostra biológica por excelência para a implementação de testes clínicos. A inovação deste estudo centra-se na utilização de técnicas complementares de separação e identificação de proteínas, nomeadamente 2-DE-MALDI-TOF/TOF MS e xxxi MudPIT. Por 2-DE foram identificadas 28 proteínas únicas a partir de 78 spots de gel enquanto por LC-MS/MS o número de proteínas identificadas aumentou para 569. A utilização de diversas ferramentas bioinformáticas permitiu ainda alocar estas proteínas a processos com significância biológica e cuja regulação tem sido amplamente descrita em FQ: remodelação dos tecidos, desequilíbrio na razão proteases/antiproteases, inflamação, estado nutricional e stresse oxidativo ou disfunção imune, entre outros. A estratégia aplicada demonstrou ser eficiente na elucidação de processos e no conhecimento mais alargado de proteínas activamente implicadas na patogénese da FQ que é corroborado por diversos estudos já publicados. Para além de estudar a componente líquida do sangue, pretendeu-se também estudar parte da sua componente sólida, as membranas de eritrócitos, uma vez que estudos têm sugerido o papel destas células no desenvolvimento de hipertensão pulmonar em FQ, embora de uma forma pouco clara. A presença da CFTR nos eritrócitos tem sido demonstrada por alguns autores através da modulação da sua actividade e/ou por métodos imunológicos. Os nossos dados confirmam a presença da CFTR na membrana dos eritrócitos e constituem, portanto, o primeiro estudo que reporta a sua identificação por MS nestas células. Contudo, esta identificação só foi possível em eritrócitos de doentes homozigóticos para a ∆F, provavelmente por haver maior acumulação desta proteína misfolded pelo controlo de qualidade da célula. O estudo da caracterização do proteoma presente nas membranas dos eritrócitos de doentes FQ revelou um número de proteínas diferencialmente expressas associadas a processos que poderão estar na base do desenvolvimento da hipertensão pulmonar nestes doentes: desregulação e desequilíbrio na manutenção da forma e deformabilidade dos eritrócitos, com consequências ao nível da incapacidade de libertação de ATP e produção do vasodilatador pulmonar óxido nítrico (NO), e aumento do seu stresse oxidativo com implicações no aumento da susceptibilidade para a peroxidação lipídica das membranas e redução das defesas contra agressões externas, podendo levar, em última instância, à deterioração da função pulmonar nestes doentes. O conjunto de resultados aqui obtidos permite oferecer um conhecimento mais consubstanciado sobre processos já elucidados mas cujos cujas proteínas associadas estavam ainda caracterizadas. xxx ii Sendo o pulmão o principal órgão afectado na FQ, torna-se claro que a amostra biológica desejável para a condução de estudos para descoberta de biomarcadores será uma biopsia deste tecido. No entanto, e por diversas razões entre as quais se destacam as éticas e as clínicas, o acesso a este tipo de amostras é muito restrito em doentes e/ou mesmo impossível quando se trata de indivíduos controlos. Várias amostras como lavado nasal e brônquico ou expectoração têm sido usadas com este objectivo, não representando contudo as características celulares do tecido uma vez que constituem fluidos segregados. A utilização das células do epitélio nasal obtidas por escovagem da cavidade nasal tem sido considerada um bom modelo biológico por mimetizar as condições das vias respiratórias inferiores e cuja colheita é deveras mais fácil. Dado que o proteoma do epitélio nasal humano estava ainda pouco caracterizado, no Capitulo IV é apresentado um estudo proteómico exaustivo das proteínas que o constituem. Através da aplicação de metodologias de pré-fraccionamento celular para extracção de proteínas solúveis e membranares, combinadas com análise de larga escala através de MudPIT, foram identificadas mais de 7000 proteínas das quais 1482 foram consideradas com confiança como características e representativas do epitélio nasal. Comparações de resultados com diversas bases de dados permitiram a identificação de várias funções associadas à manutenção e função de um epitélio estruturado, na percepção e resposta a agressões externas, assim como uma significativa sobreposição entre proteínas identificadas no epitélio brônquico e neste epitélio nasal e sua correlação com diversas doenças respiratórias, entre as quais cancro do pulmão, síndroma respiratório agudo grave, pneumonite, asma e mesmo FQ. A conjugação das várias observações apoia a hipótese que o epitélio nasal reflecte certos aspectos das vias respiratórias inferiores e contribui significativamente para o incremento de conhecimento do fenótipo do epitélio respiratório, permitindo análises comparativas em condições patológicas como a FQ. A informação resultante da caracterização do proteoma das células do epitélio nasal serviu como base para identificação de proteínas diferencialmente expressas como consequência de FQ, apresentada no Capítulo V. A identificação de processos relacionados com a remodelação dos tecidos, o stresse oxidativo e a inflamação foram identificados neste epitélio como associados a FQ. Também foram evidenciados a disfunção mitocondrial e desregulação nos mecanismos de produção energética, metabolismo da glucose ou degradação da matriz extracelular, entre outros. A identificação de proteínas diferencialmente expressas e que interactuam com a CFTR e a identificação/participação de proteínas conhecidas como modificadoras da FQ revestese também de fulcral importância para patogénese pulmonar da FQ. Em suma, os resultados obtidos nas várias amostras biológicas de doentes FQ estudas, por diferentes abordagens proteómicas, permitiram obter conhecimentos únicos que consideramos de base sólida para uma melhor compreensão da patologia FQ e possibilitar o desenho de estudos posteriores e dedicados a proteínas/funções elucidadas com o objectivo de validação de alguns potenciais biomarcadores de diagnóstico/prognóstico/monitorização e/ou alvos terapêuticos específicos que permitam distinguir a FQ de outras doenças respiratórias.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT SFRH/BD/27906/2006); Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional(FEDER POCI/SAU-MMO/56163/2004

Optimizing the discovery of predictors of vaso-occlusion in sickle-cell disease by proteomics

Painful crises are the major sickle-cell disease (SCD) clinical manifestation probably due to significant increase in dense red blood cells (RBC) and reduction of their ability to pass through capillaries. Using proteomic strategies (see figure below), we aimed to discover novel SCD prognosis biomarkers as early predictors of the transition from steady-state to vaso-occlusive crises thus, allowing a prompt and specific therapeutic intervention

Plasma and red blood cell proteome in sickle-cell disease

Sickle-cell disease (SCD) is a clinically heterogeneous autosomal recessive monogenic chronic anaemia characterized by recurrent episodes of severe vaso-occlusion, haemolysis and infection. Painful crises are the major SCD clinical manifestation probably due to significant increase in dense red blood cells (RBC) and reduction of their ability to pass through capillaries. Using proteomic strategies, we aim to discover novel and better SCD prognosis biomarkers as early predictors of the transition from steady-state to crisis namely vaso-occlusive episodes, thus, allowing a prompt and specific therapeutic interventio

Tobacco smoke occupational exposure: biomarkers of biological damage

High concentration of toxic substances emanated from tobacco smoke in entertainment places such as restaurants, bars and nightclubs may compromise indoor air quality (IAQ) generating environments of likelihood health risk. Their employees, particularly those exposed to second-hand smoke, are at increased risk for developing chronic respiratory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma and lung cancer. Objectives In this work, we aimed at evaluating relationships between occupational ETS exposure, biological damage (DNA or proteome alterations) and putative respiratory dysfunctions

Supramolecular organizations in the aerobic respiratory chain of Escherichia coli

The organization of respiratory chain complexes in supercomplexes has been shown in the mitochondria of several eukaryotes and in the cell membranes of some bacteria. These supercomplexes are suggested to be important for oxidative phosphorylation efficiency and to prevent the formation of reactive oxygen species. Here we describe, for the first time, the identification of supramolecular organizations in the aerobic respiratory chain of Escherichia coli, including a trimer of succinate dehydrogenase. Furthermore, two heterooligomerizations have been shown: one resulting from the association of the NADH:quinone oxidoreductases NDH-1 and NDH-2, and another composed by the cytochrome bo3 quinol:oxygen reductase, cytochrome bd quinol:oxygen reductase and formate dehydrogenase (fdo). These results are supported by blue native-electrophoresis, mass spectrometry and kinetic data of wild type and mutant E . coli strains

HCV-coinfection is related to an increased HIV-1 reservoir size in cART-treated HIV patients: a cross-sectional study

In HIV-1/HCV-coinfected patients, chronic HCV infection leads to an increased T-lymphocyte immune activation compared to HIV-monoinfected patients, thereby likely contributing to increase HIV-1 reservoir that is the major barrier for its eradication. Our objective was to evaluate the influence of HCV coinfection in HIV-1 viral reservoir size in resting (r) CD4+ T-cells (CD25-CD69-HLADR-). Multicenter cross-sectional study of 97 cART-treated HIV-1 patients, including 36 patients with HIV and HCV-chronic co-infection without anti-HCV treatment, 32 HIV patients with HCV spontaneous clearance and 29 HIV-monoinfected patients. rCD4+ T-cells were isolated and total DNA was extracted. HIV viral reservoir was measured by Alu-LTR qPCR. Differences between groups were calculated with a generalized linear model. Overall, 63.9% were men, median age of 41 years and Caucasian. Median CD4+ and CD8+ T-lymphocytes were 725 and 858 cells/mm 3 , respectively. CD4+ T nadir cells was 305 cells/mm 3 . Proviral HIV-1 DNA size was significantly increased in chronic HIV/HCV-coinfected compared to HIV-monoinfected patients (206.21 ± 47.38 vs. 87.34 ± 22.46, respectively; P = 0.009), as well as in spontaneously clarified HCV co-infected patients when compared to HIV-monoinfected individuals (136.20 ± 33.20; P = 0.009). HIV-1/HCV co-infected patients showed a larger HIV-1 reservoir size in comparison to HIV-monoinfected individuals. This increase could lead to a greater complexity in the elimination of HIV-1 reservoir in HIV-1/HCV-coinfected individuals, which should be considered in the current strategies for the elimination of HIV-1 reservoir.Financial support was provided by the Instituto de Salud Carlos III to VB (PI15CIII/00031), by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness to MC (SAF2016–78480-R) and The SPANISH AIDS Research Network RD16CIII/0002/0001, RD16CIII/0002/0002 and RD16/0025/0013 - ISCIII – FEDER. MRLP is supported by ISCIII - Subdirección General de Evaluacion and European Funding for Regional Development (FEDER) (PIE 13/00040 and RD12/0017/0017 RETIC de SIDA). C.P. is supported by the Portuguese Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) (grant number SFRH/ BPD/77448/2011 is part of the EDCTP2 programme supported by the European Union). V.B., A.F.R. and N.R. are supported by the Miguel Servet programme from Fondo de Investigación Sanitaria (ISCIII) (grant number CP13/00098, CP14/CIII/00010 and CP14/00198, respectively)

Proteomics in Detection and Monitoring Chronic Lung Diseases: The Human Nasal Epithelium as a Molecular Model

Asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are major causes of mortality and morbidity worldwide. The current state-of-art diagnosis and management schemes are suboptimal for both diseases as the incidence of asthma has risen by 250% over the last two decades and COPD is estimated to become the third leading cause of death worldwide within the next decade. Additionally, these diseases represent a very important threat to global economies in direct and indirect medical costs and lost working days [1,2]. Asthma is a chronic inflammatory disorder of the airways associated with airway hyperresponsiveness that leads to recurrent episodes of wheezing, breathlessness, chest tightness and coughing. These episodes are usually associated with widespread, but variable, airflow obstruction within the lung [1]. Chronic airflow obstruction is also characteristic of COPD but, in contrast to asthma, is not fully reversible, even under the action of bronchodilators, and is usually progressive. A combination of small airway disease -obstructive bronchiolitis - and parenchymal destruction - emphysema, leads to COPD clinical manifestation [2]. A number of factors influence a person’s risk of developing these lung diseases, which include host factors, primarily genetic, and environmental factors, such as allergens and tobacco smoke in asthma and COPD, respectivel

Profiling the erythrocyte membrane proteome isolated from patients diagnosed with chronic obstructive pulmonary disease

Structural and metabolic alterations in erythrocytes play an important role in the pathophysiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Whether these dysfunctions are related to the modulation of erythrocyte membrane proteins in patients diagnosed with COPD remains to be determined. Herein, a comparative proteomic profiling of the erythrocyte membrane fraction isolated from peripheral blood of smokers diagnosed with COPD and smokers with no COPD was performed using differential 16O/18O stable isotope labeling. A total of 219 proteins were quantified as being significantly differentially expressed within the erythrocyte membrane proteomes of smokers with COPD and healthy smokers. Functional pathway analysis showed that the most enriched biofunctions were related to cell-to-cell signaling and interaction, hematological system development, immune response, oxidative stress and cytoskeleton. Chorein (VPS13A), a cytoskeleton related protein whose defects had been associated with the presence of cell membrane deformation of circulating erythrocytes was found to be down-regulated in the membrane fraction of erythrocytes obtained from COPD patients. Methemoglobin reductase (CYB5R3) was also found to be underexpressed in these cells, suggesting that COPD patients may be at higher risk for developing methemoglobinemia. This article is part of a Special Issue entitled: “Integrated omics— Functional applications to blood and blood therapeutics”