9 research outputs found
Interaction fontionnelle entre le système de tolérance des lésions et le checkpoint des dommages à l'ADN : conséquences sur la stabilité du génome et l'oncogenèse
Our genome is continuously exposed to DNA damaging agents. In order to preserve the integrity of their genome, cells have evolved a DNA damage signalling pathway known as checkpoint. Some lesions may persist when cells enter the S-phase and halt the progression of replicative DNA polymerases. This can cause prolonged replication forks stalling which threaten the stability of the genome. To preserve the integrity of genetic information, cells have developed a tolerance pathway which involves specialized DNA polymerases, called translesion DNA polymerases (TLS Pols). These polymerases have the unique ability to accommodate the damaged bases thanks to their catalytic site. In this process, PCNA acts as a scaffold for many proteins involved in DNA metabolism. The mechanisms governing the exchanges between different PCNA partners are not well understood. Among the proteins that interact with PCNA, CDT1, p21 and PR-Set7/set8 are characterized by a high binding affinity. These proteins have a particular interaction domain with PCNA, called "PIP degron", which promotes their proteasomal degradation via the E3 ubiquitin ligase CRL4Cdt2. After UV-C irradiation, the replication initiation factor CDT1 is rapidly degraded in a PIP degron-dependent manner. During the first part of my work, we wanted to understand the functional role of this degradation. Our results have shown that inhibition of CDT1 degradation by CRL4Cdt2 in mammalian cells, compromises the relocalisation of TLS Pol eta and Pol kappato nuclear foci after UV-C irradiation. We also found that only the proteins which contain a PIP degron interfere with the formation of Pol eta foci. Mutagenesis experiments on CDT1 PIP degron revealed that a threonine residue conserved among PIP degrons is essential for inhibiting foci formation of at least two TLS polymerases. This results suggest that CRL4Cdt2-dependent degradation of proteins containing PIP degrons regulates the recruitment of TLS polymerases at sites of UV-induced DNA damage.During the second part of my thesis, we studied DNA damage checkpoint regulation during embryogenesis. Indeed, in early embryos, the DNA damage checkpoint is silent until the mid-blastula transition (MBT) due to maternal inhibiting factors. In this work, we have shown, both in vitro and in vivo, that the E3 ubiquitin ligase RAD18, a major regulator of translesion DNA synthesis, is a limiting factor for the checkpoint activation in Xenopus embryos. We have also shown that RAD18 depletion leads to the activation of DNA damage checkpoints by inducing replication fork uncoupling in front of the lesions. Furthermore, we showed that the abundance of RAD18 and PCNA monoubiquitination (PCNAmUb) is regulated during embryonic development. Near the MBT, the increased abundance of DNA limits the availability of RAD18, thereby reducing the amount of PCNAmUb and inducing the de-repression of the checkpoint. Moreover, we have shown that this embryonic-like regulation can be reactivated in somatic mammalian cells by ectopic expression of RAD18, conferring resistance to DNA damaging. Finally, we found high RAD18 levels in glioblastoma cancer stem cells highly resistant to DNA damage. All together, these data propose RAD18 as a critical factor that inhibits DNA damage checkpoint in early embryos and suggests that dysregulation of RAD18 expression may have an unexpected oncogenic potentialNotre génome subit constamment les effets néfastes des agents endommageant de l'ADN. Afin de se protéger de ces effets délétères, les cellules disposent d’un système de détection des dommages à l’ADN (point de contrôle ou « checkpoint »). Certaines lésions peuvent persister quand les cellules entrent en phase S et inhiber ainsi la synthèse de l’ADN en interférant avec les ADN polymérases réplicatives. Ceci peut provoquer des arrêts prolongés des fourches de réplication ce qui fragilise l’ADN. Pour préserver l’intégrité de l’information génétique, les cellules ont développé une voie de tolérance qui implique des ADN polymérases spécialisées dans la réplication des lésions, appelées ADN Polymérases translésionnelles (Pols TLS). Dans ce processus, PCNA joue le rôle de facteur d’échafaudage pour de nombreuses protéines impliquées dans le métabolisme de l'ADN. Les mécanismes de régulation des échanges entre les différents partenaires de PCNA ne sont pas très bien compris. Parmi les protéines qui interagissent avec PCNA, CDT1, p21 ou encore PR-Set7/Set8 sont caractérisées par une forte affinité pour cette protéine. Ces dernières possèdent un motif d’interaction particulier avec PCNA, nommé « PIP degron », qui favorise leur protéolyse d'une manière dépendante de l’E3 ubiquitine ligase CRL4Cdt2. Après irradiation aux UV-C, le facteur d’initiation de la réplication CDT1 est rapidement détruit d’une manière dépendante de son PIP degron, Dans la première partie de mon travail, j’ai contribué à comprendre le rôle fonctionnel de cette dégradation. Les résultats obtenus ont fourni des évidences expérimentales qui montrent que l’inhibition de la dégradation de CDT1 par CRL4Cdt2 dans les cellules de mammifères compromet la relocalisation des TLS Pol eta et Pol kappaen foyers nucléaires induits par les irradiations UV-C. On a constaté que seules les protéines qui contiennent un PIP degron interfèrent avec la formation de foyers de Pol eta. La mutagenèse du PIP degron de CDT1 a révélé qu'un résidu de thréonine conservé parmi les PIP degrons est essentiel pour l'inhibition de la formation des foyers des TLS Polymérases. Les résultats obtenus suggèrent que l’élimination de protéines contenant des PIP degrons par la voie CRL4Cdt2 régule le recrutement de TLS Polymérases au niveau des sites des dommages induits par les UV-C.Dans un second temps, on s’est intéressé à l’étude du checkpoint des dommages à l’ADN au cours de l’embryogénèse. En effet, dans les embryons précoces, le checkpoint est silencieux jusqu'à la transition de mid-blastula (MBT), en raison de facteurs maternels limitants. Dans ce travail, nous avons montré, aussi bien in vitro qu’in vivo, que l’ubiquitine ligase de type E3 RAD18, un régulateur majeur de la translésion, est un facteur limitant pour l’activation du checkpoint dans les embryons de xénope. Nous avons montré que l'inactivation de la fonction de l’ubiquitine ligase RAD18 conduit à l'activation du checkpoint par un mécanisme qui implique l’arrêt des fourches de réplication en face des lésions produites par les UV-C. De plus, nous avons montré que l'abondance de RAD18 et de PCNA monoubiquitiné (PCNAmUb) est régulée au cours de l’embryogénèse. À l’approche de la MBT, l’abondance de l'ADN limite la disponibilité de RAD18, réduisant ainsi la quantité de PCNAmUb et induisant la dé-répression du checkpoint. En outre, nous avons montré que cette régulation embryonnaire peut être réactivée dans les cellules somatiques de mammifères par l'expression ectopique de RAD18, conférant une résistance aux agents qui causent des dommages à l'ADN. Enfin, nous avons trouvé que l'expression de RAD18 est élevée dans les cellules souches cancéreuses de glioblastome hautement résistantes aux dommages de l'ADN. En somme, ces données proposent RAD18 comme un facteur embryonnaire critique qui inhibe le point de contrôle des dommages de l’ADN et suggèrent que le dérèglement de l’expression de RAD18 peut avoir un potentiel oncogénique inattend
Regulation of DNA Replication in Early Embryonic Cleavages
Early embryonic cleavages are characterized by short and highly synchronous cell cycles made of alternating S- and M-phases with virtually absent gap phases. In this contracted cell cycle, the duration of DNA synthesis can be extraordinarily short. Depending on the organism, the whole genome of an embryo is replicated at a speed that is between 20 to 60 times faster than that of a somatic cell. Because transcription in the early embryo is repressed, DNA synthesis relies on a large stockpile of maternally supplied proteins stored in the egg representing most, if not all, cellular genes. In addition, in early embryonic cell cycles, both replication and DNA damage checkpoints are inefficient. In this article, we will review current knowledge on how DNA synthesis is regulated in early embryos and discuss possible consequences of replicating chromosomes with little or no quality control
Functional interaction between the DNA damage tolerance pathway and the DNA damage checkpoint : implications for genome stability and oncogenesis
Notre génome subit constamment les effets néfastes des agents endommageant de l'ADN. Afin de se protéger de ces effets délétères, les cellules disposent d’un système de détection des dommages à l’ADN (point de contrôle ou « checkpoint »). Certaines lésions peuvent persister quand les cellules entrent en phase S et inhiber ainsi la synthèse de l’ADN en interférant avec les ADN polymérases réplicatives. Ceci peut provoquer des arrêts prolongés des fourches de réplication ce qui fragilise l’ADN. Pour préserver l’intégrité de l’information génétique, les cellules ont développé une voie de tolérance qui implique des ADN polymérases spécialisées dans la réplication des lésions, appelées ADN Polymérases translésionnelles (Pols TLS). Dans ce processus, PCNA joue le rôle de facteur d’échafaudage pour de nombreuses protéines impliquées dans le métabolisme de l'ADN. Les mécanismes de régulation des échanges entre les différents partenaires de PCNA ne sont pas très bien compris. Parmi les protéines qui interagissent avec PCNA, CDT1, p21 ou encore PR-Set7/Set8 sont caractérisées par une forte affinité pour cette protéine. Ces dernières possèdent un motif d’interaction particulier avec PCNA, nommé « PIP degron », qui favorise leur protéolyse d'une manière dépendante de l’E3 ubiquitine ligase CRL4Cdt2. Après irradiation aux UV-C, le facteur d’initiation de la réplication CDT1 est rapidement détruit d’une manière dépendante de son PIP degron, Dans la première partie de mon travail, j’ai contribué à comprendre le rôle fonctionnel de cette dégradation. Les résultats obtenus ont fourni des évidences expérimentales qui montrent que l’inhibition de la dégradation de CDT1 par CRL4Cdt2 dans les cellules de mammifères compromet la relocalisation des TLS Pol eta et Pol kappaen foyers nucléaires induits par les irradiations UV-C. On a constaté que seules les protéines qui contiennent un PIP degron interfèrent avec la formation de foyers de Pol eta. La mutagenèse du PIP degron de CDT1 a révélé qu'un résidu de thréonine conservé parmi les PIP degrons est essentiel pour l'inhibition de la formation des foyers des TLS Polymérases. Les résultats obtenus suggèrent que l’élimination de protéines contenant des PIP degrons par la voie CRL4Cdt2 régule le recrutement de TLS Polymérases au niveau des sites des dommages induits par les UV-C.Dans un second temps, on s’est intéressé à l’étude du checkpoint des dommages à l’ADN au cours de l’embryogénèse. En effet, dans les embryons précoces, le checkpoint est silencieux jusqu'à la transition de mid-blastula (MBT), en raison de facteurs maternels limitants. Dans ce travail, nous avons montré, aussi bien in vitro qu’in vivo, que l’ubiquitine ligase de type E3 RAD18, un régulateur majeur de la translésion, est un facteur limitant pour l’activation du checkpoint dans les embryons de xénope. Nous avons montré que l'inactivation de la fonction de l’ubiquitine ligase RAD18 conduit à l'activation du checkpoint par un mécanisme qui implique l’arrêt des fourches de réplication en face des lésions produites par les UV-C. De plus, nous avons montré que l'abondance de RAD18 et de PCNA monoubiquitiné (PCNAmUb) est régulée au cours de l’embryogénèse. À l’approche de la MBT, l’abondance de l'ADN limite la disponibilité de RAD18, réduisant ainsi la quantité de PCNAmUb et induisant la dé-répression du checkpoint. En outre, nous avons montré que cette régulation embryonnaire peut être réactivée dans les cellules somatiques de mammifères par l'expression ectopique de RAD18, conférant une résistance aux agents qui causent des dommages à l'ADN. Enfin, nous avons trouvé que l'expression de RAD18 est élevée dans les cellules souches cancéreuses de glioblastome hautement résistantes aux dommages de l'ADN. En somme, ces données proposent RAD18 comme un facteur embryonnaire critique qui inhibe le point de contrôle des dommages de l’ADN et suggèrent que le dérèglement de l’expression de RAD18 peut avoir un potentiel oncogénique inattenduOur genome is continuously exposed to DNA damaging agents. In order to preserve the integrity of their genome, cells have evolved a DNA damage signalling pathway known as checkpoint. Some lesions may persist when cells enter the S-phase and halt the progression of replicative DNA polymerases. This can cause prolonged replication forks stalling which threaten the stability of the genome. To preserve the integrity of genetic information, cells have developed a tolerance pathway which involves specialized DNA polymerases, called translesion DNA polymerases (TLS Pols). These polymerases have the unique ability to accommodate the damaged bases thanks to their catalytic site. In this process, PCNA acts as a scaffold for many proteins involved in DNA metabolism. The mechanisms governing the exchanges between different PCNA partners are not well understood. Among the proteins that interact with PCNA, CDT1, p21 and PR-Set7/set8 are characterized by a high binding affinity. These proteins have a particular interaction domain with PCNA, called "PIP degron", which promotes their proteasomal degradation via the E3 ubiquitin ligase CRL4Cdt2. After UV-C irradiation, the replication initiation factor CDT1 is rapidly degraded in a PIP degron-dependent manner. During the first part of my work, we wanted to understand the functional role of this degradation. Our results have shown that inhibition of CDT1 degradation by CRL4Cdt2 in mammalian cells, compromises the relocalisation of TLS Pol eta and Pol kappato nuclear foci after UV-C irradiation. We also found that only the proteins which contain a PIP degron interfere with the formation of Pol eta foci. Mutagenesis experiments on CDT1 PIP degron revealed that a threonine residue conserved among PIP degrons is essential for inhibiting foci formation of at least two TLS polymerases. This results suggest that CRL4Cdt2-dependent degradation of proteins containing PIP degrons regulates the recruitment of TLS polymerases at sites of UV-induced DNA damage.During the second part of my thesis, we studied DNA damage checkpoint regulation during embryogenesis. Indeed, in early embryos, the DNA damage checkpoint is silent until the mid-blastula transition (MBT) due to maternal inhibiting factors. In this work, we have shown, both in vitro and in vivo, that the E3 ubiquitin ligase RAD18, a major regulator of translesion DNA synthesis, is a limiting factor for the checkpoint activation in Xenopus embryos. We have also shown that RAD18 depletion leads to the activation of DNA damage checkpoints by inducing replication fork uncoupling in front of the lesions. Furthermore, we showed that the abundance of RAD18 and PCNA monoubiquitination (PCNAmUb) is regulated during embryonic development. Near the MBT, the increased abundance of DNA limits the availability of RAD18, thereby reducing the amount of PCNAmUb and inducing the de-repression of the checkpoint. Moreover, we have shown that this embryonic-like regulation can be reactivated in somatic mammalian cells by ectopic expression of RAD18, conferring resistance to DNA damaging. Finally, we found high RAD18 levels in glioblastoma cancer stem cells highly resistant to DNA damage. All together, these data propose RAD18 as a critical factor that inhibits DNA damage checkpoint in early embryos and suggests that dysregulation of RAD18 expression may have an unexpected oncogenic potentia
Preserving Genome Integrity during the Early Embryonic DNA Replication Cycles
During the very early stages of embryonic development chromosome replication occurs under rather challenging conditions, including a very short cell cycle, absence of transcription, a relaxed DNA damage response and, in certain animal species, a highly contracted S-phase. This raises the puzzling question of how the genome can be faithfully replicated in such a peculiar metabolic context. Recent studies have provided new insights into this issue, and unveiled that embryos are prone to accumulate genetic and genomic alterations, most likely due to restricted cellular functions, in particular reduced DNA synthesis quality control. These findings may explain the low rate of successful development in mammals and the occurrence of diseases, such as abnormal developmental features and cancer. In this review, we will discuss recent findings in this field and put forward perspectives to further study this fascinating question
HLTF Promotes Fork Reversal, Limiting Replication Stress Resistance and Preventing Multiple Mechanisms of Unrestrained DNA Synthesis
DNA replication stress can stall replication forks, leading to genome instability. DNA damage tolerance pathways assist fork progression, promoting replication fork reversal, translesion DNA synthesis (TLS), and repriming. In the absence of the fork remodeler HLTF, forks fail to slow following replication stress, but underlying mechanisms and cellular consequences remain elusive. Here, we demonstrate that HLTF-deficient cells fail to undergo fork reversal in vivo and rely on the primase-polymerase PRIMPOL for repriming, unrestrained replication, and S phase progression upon limiting nucleotide levels. By contrast, in an HLTF-HIRAN mutant, unrestrained replication relies on the TLS protein REV1. Importantly, HLTF-deficient cells also exhibit reduced double-strand break (DSB) formation and increased survival upon replication stress. Our findings suggest that HLTF promotes fork remodeling, preventing other mechanisms of replication stress tolerance in cancer cells. This remarkable plasticity of the replication fork may determine the outcome of replication stress in terms of genome integrity, tumorigenesis, and response to chemotherapy