Koleszterint felismerő monoklonális IgG ellenanyagok karakterizálása = Characterization of cholesterol binding monoclonal IgB antibodies

Az általunk korábban létrehozott anti-koleszterin ellenanyagot termelő hibridómákból kiválasztottunk kettőt, amelyek nagy mennyiségben szekretáltak IgG3 izotípusú ellenanyagot, és ezek az ellenanyagok elővizsgálatokban erősen kötődtek koleszterinnel fedett ELISA lemezekhez. Miután megtermeltük és kitisztítottuk a szükséges mennyiségű ellenanyagot, elvégeztük a két ellenanyag (AC1 és AC8) részletes karakterizálását. Megvizsgáltuk az ellenanyagok lipid- ill. ezen belül szteroid specificitását, valamint a koleszterinnel való kapcsolat affinitását. Megtörtént a lipoproteinek és a mACHA-k reakciójának jellemzése is. Vizsgáltuk az ellenanyagok kötődését endotélsejtekhez és különböző leukocitákhoz. Minthogy a mACHA-k csak ez utóbbiakhoz kötődtek, a tervbe vett funkcionális teszteket leukocitákon hajtottuk végre. Megfigyeltük, hogy a mACHA-k módosítják a HIV koreceptorként működő CXCR4 membrán lokalizációját, és feltehetően ennek hatására gátolják a HIV bejutását a célsejtekbe. Eredményeinket 2 nemzetközi és 2 hazai konferencián adtuk elő, valamint 2 megjelent nemzetközi (pályázó egyikben megosztott elsőszerzős, másikban utolsó szerzős), 1 hazai közleményben tettük közzé (összesített impaktfaktor: 8,36), illetve 1 közleményt beküldtünk egy rangos nemzetközi folyóirathoz, ahol az jelenleg elbírálás alatt áll. | We chose two of our hybridoma clones previously generated against cholesterol, which produced high amount of IgG3 isotype antibodies binding to cholesterol coated plates. After we produced and purified appropriate amount of antibodies, detailed characterization of the two antibodies (AC1 and AC8) was performed. Antibody specificity toward lipids (including steroids) has been tested and precise affinity measurements were also performed. Reaction between lipoproteins and mACHAs has been tested. Binding of mACHA to endothelial cells and leukocytes was assessed. Since mACHAs bound only to the latter, we performed functional assays with leukocytes. Membrane localization of HIV coreceptor CXCR4 was modified by mACHAs and HIV entry could be inhibited by the antibodies. Our results has been published at 2 international and 2 Hungarian conferences, in 1 Hungarian and 2 international peer reviewed journals (total impact factor: 8.36) and novel results (inhibition of HIV production) has been submitted into a high-ranked international journal

Increased plasma von Willebrand factor antigen levels but normal von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity in preeclampsia.

The activity of ADAMTS13, the von Willebrand factor (VWF) cleaving protease is low in several conditions, including HELLP (haemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet count) syndrome. As HELLP syndrome develops in most cases on the basis of preeclampsia, our aim was to determine whether plasma ADAMTS13 activity is decreased in preeclampsia. Sixty-seven preeclamptic patients, 70 healthy pregnant women and 59 healthy non-pregnant women were involved in this case-control study. Plasma ADAMTS13 activity was determined with the FRETS-VWF73 assay, while VWF antigen (VWF:Ag) levels with an enzyme-linked immunosorbent assay. The multimeric pattern of VWF was analyzed by SDS-agarose gel electrophoresis. There was no significant difference in plasma ADAMTS13 activity between the preeclamptic and the healthy pregnant and non-pregnant groups (median [25-75 percentile]: 98.8 [76.5-112.8] %, 96.3 [85.6-116.2] % and 91.6 [78.5-104.4] %, respectively; p > 0.05). However, plasma VWF:Ag levels were significantly higher in preeclamptic patients than in healthy pregnant and non-pregnant women (187.1 [145.6-243.1] % versus 129.3 [105.1-182.8] % and 70.0 [60.2-87.3] %, respectively; p < 0.001). The multimeric pattern of VWF was normal in each group. Primiparas had lower plasma ADAMTS13 activity than multi-paras (92.6 [75.8-110.6] % versus 104.2 [92.1-120.8] %; p = 0.011). No other relationship was found between clinical characteristics, laboratory parameters and plasma ADAMTS13 activity in either study group. In conclusion, plasma ADAMTS13 activity is normal in preeclampsia despite the increased VWF:Ag levels. However, further studies are needed to determine whether a decrease in plasma ADAMTS13 activity could predispose preeclamptic patients to develop HELLP syndrome

Humán és bakteriális hősokkfehérjék komplementaktiváló képességének összehasonlító vizsgálata = Study on the complement activating ability of human and bacterial heat-shock proteins

A kutatási periódusban 4 célkitűzésben vizsgáltuk humán és bakteriális hősokkfehérjék komplementaktiváló képességét. A komplementaktiváció legfontosabb regulátorainak, a Hsp60/65 ellens antitestek vonatkozásában azt kaptuk, hogy jelentős reguláló tényező az IL-6 promóter -174-es polimorfizmusa. Kimutattuk továbbá, hogy az anti-Hsp60 autoantitestek a természetes autoantitest repertoárba tartoznak, valamint epitóp szinten is elkülöníthetők a az anti-Hsp65 antitestektől. Eredményeink jelentőségét az adja, hogy eddig csak korlátozott ismeretanyaggal rendelkeztünk az anti-Hsp autoantitestek összefüggéseire és regulációjára vonatkozóan. A pályázat támogatásával az erre vonatkozó részletes immunológiai ismeretanyag gazdagodott. A Hsp70 komplementaktiváló képességének in vitro vizsgálatát megnehezítette a rekombináns fehérjék endotoxin szennyezettsége, ami mellett nem tudtuk megítélni a komplementaktiváció pontos mechanizmusát. A Hsp70 további vizsgálatát in vivo, klinikai beteganyagon valósítottuk meg, ezek a megfigyeléseink lehetővé teszik egy későbbi, in vivo komplementaktivációra vonatkozó munkahipotézis kialakítását. Eredményeinknek gyakorlati vonatkozását az adja, hogy a hősokkfehérjék immunológiai szerepe egyre több klinikai állapotban nyer bizonyítást, és az ezzel kapcsolatos részletes szabályozó folyamatok jellemzése hozzájárul az adott kórállapotok pontosabb megértéséhez. | The complement (C) activating ability of human and bacterial heat shock proteins was investigated along four objectives in this project. Investigating the main regulator of Hsp60/Hsp65 induced C activation, i.e. anti-Hsp antibodies, the primary regualting role of the IL-6 -174 promoter polymorphism was shown. Furthermore, evidences were obtained about the natural autoantibody properties of anti-Hsp60 IgM antibodies. These antibodies can also be distinguished from anti-Hsp65 antibodies based on their epitope specificities. There were only limited data available until now on the regulation and associations of anti-Hsp autoantibodies. With the support of the current research grant detailed immunological knowledge has been obtained on the above topic. The in vitro investigations on the Hsp70 induced C activation was hampered by the endotoxin contamination of the recombinant Hsp70 preparations. Therefore, our subsequent in vivo investigation on Hsp70 was done in clinical studies. The results of these provide base for follow-up in vivo research to determine the exact mechanism of Hsp70 induced C acitvaiton in vivo. The physiological relvance of our results is related to the fact of recent observations about the roles of heat shock proteins in different human diseases. Understanding the precise immunological mechanisms behind these associations will help in the future to appreciate the clinical consequences of Hsps in more depth

Levels of von Willebrand factor antigen and von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity predict clinical events in chronic heart failure.

Decreased activity of ADAMTS13, the von Willebrand factor (VWF) cleaving protease, was recently reported in cardiovascular diseases and in hepatic failure. Chronic heart failure (CHF) is characterised by abnormalities of left ventricular function accompanied by the failure of the liver and dysregulation of endothelial activation. Therefore, the aim of our study was to measure ADAMTS13 activity in CHF, and determine the prognostic value of VWF and ADAMTS13 on major clinical events in CHF. ADAMTS13 activity (measured by FRETS-VWF73 substrate) was decreased in CHF (n = 152, left ventricular ejection fraction <45%), and it correlated negatively with B-type natriuretic peptide (BNP) NYHA (New York Heart Association) classes, markers of synthetic capacity of the liver and endothelial dysfunction (all p < 0.005). Both, high VWF:Ag levels (hazard ratio [HR] 1.52, 95% confidence interval [CI] 1.189-1.943), and low ADAMTS13/VWF:Ag ratios (HR 0.70, 95% CI 0.58-0.84) independently and significantly predicted short-term (1 year follow-up) clinical adverse events in heart failure (HF). Decreased activity of ADAMTS13 with concomitant high VWF:Ag levels is a significant independent predictor of clinical events in CHF. The levels of the two molecules may integrate the impaired synthetic capacity of the liver and the disturbed endothelial regulation and can therefore be a useful tool to predict clinical events in CHF

A T-sejt aktiváció/celluláris immunválasz szabályozása: membrán mikrodomén-függő immunmoduláció és az ösztrogén közvetített nem-genomiális hormonális hatások vizsgálata = Regulation of the T-cell mediated immune response: investigation of membrane microdomain-dependent immunomodulation and estrogen-mediated nongenomial hormonal effects

A T49696 OTKA projekt (3 év) támogatásával elért főbb eredmények: Kimutattuk, hogy a sejtmembrán "tutajok" szfingolipid és koleszterin alkotóelemei fontos szabályozói a T sejtek aktiváció/sejthalál egyensúlyának, valamint a polarizált helper T sejtek válaszképességének. Megmutattuk ezen folyamatokban a ceramidok, a Kv és Cav ioncsatornák alapvető szerepét is. Az általunk leírt szignálintegrációs modell újabb immunmodulációs lehetőségeket kínál. Kimutattuk, hogy az ösztrogén steroid hormonok gyors, nem-genomiális jeleket indukálnak T és B limfocitákon (foszforiláció, szelektív kalcium szignál, stb.), egy még nem azonosított membránreceptoron keresztül, és fokozzák a T sejt-függő, antigén-indukált ellenanyagtermelést. Eredményeink elősegíthetik az ösztrogénszint és egyes autoimmunbetegségek közötti összefüggések hátterének mélyebb megértését. Új, koleszterin-specifikus IgG monoklonális ellenanyagokat (AC1, AC8) állítottunk elő, melyeknek megmutattuk celluláris-koleszterin diagnosztikai célokra történő alkalmazhatóságát. Ezen ellenanyagok képesek a HIV-infekció/ termelés gátlására monocita-makrofág és T sejteken in vitro, elsősorban a célsejtek plazmamembránjának (lipid tutajok, HIV receptorok) molekuláris átrendezése révén. A projekt eredményeit felhasználva 2 PhD tudományos fokozat született; 6 referált tudományos közlemény nemzetközi folyóiratban; 4 új kongresszusi absztrakt, melyekből folyamatos a publikálás (3 publikáció-kész közlemény) | Main results of the project T49696 supported by OTKA (3 years): We have shown that two lipid constituents of rafts (sphingolipids or cholesterol) are critical in regulating the balance of activation/cell death signaling in T cells or the functional responses of polarized Th1 or Th2 cells. Specific, important contribution of ceramides, Kv and Cav ion channels was also shown in these processes, offering new possibilites of immunomodulation. Rapid, non-genomial signals (selective phosphorylation and Ca2+ signals or NFκB nuclear translocation) of estrogen steroid hormones have been shown in both T and B lymphocytes, that may be partly responsible for augmentation of the T-dependent humoral immune response observed in in vivo mice studies. These effects, mediated by a yet unidentified E2 membrane receptor, may help us to reveal and understand the relationship between estrogen levels and several autoimmune diseases. We generated novel cholesterol-specific IgG antibodies (AC1 and AC8), that may serve as diagnostic markers of clustered cholesterol (cell-free or cellular). As one of their most intriguing biological activity - inhibition of HIV entry/production in vitro - has been elucidated and shown that the major mechanism of action is remodeling of the target cells' plasma membrane (rafts and HIV receptors). 2 PhD degrees were received based on these results; 6 reviewed research articles; 4 new Congress Abstracts (publication is continuous: 3 publication-ready manuscripts

Analysis of interactions between inflammatory and vasoregulatory pathways in chronic heart failure: application of logical analysis of data, a novel data-mining tool = Analysis of interactions between inflammatory and vasoregulatory pathways in chronic heart failure: application of logical analysis of data, a novel data-mining tool

Pályázatunk keretein belül a következő feladatokat valósítottuk meg: 1, Klinikai vizsgálatokat tervezetünk és kiviteleztünk szívelégtelenségben, tüdőgyulladás eredetű szepszisben, preeclampsiában és colorectalis carcinomában szenvedő betegek bevonásával. Vizsgálataink során többféle biomarker, genetikai polimorfizmus és alap klinikai adat mérésére és rögzítésére került sor. Méréseink eredményeiről szakkcikkekben és doktori disszertációkban számoltink be, valamint egy szabadalom bejelentésére is sor kerül. A klinikai vizsgálatok során felépített adatbázisok képezték további elemzéseink és vizsgálataink alapját. 2, Az ELTE Operációkutatási Tanszék munkatársai által fejlesztett logikai adatanalízis algoritmus továbbfejlesztésére és valós adatokon történő kipróbálására került sor a szívelégtelenség adatbázis elemzésével. A futtatások eredményeit elemezve kiválasztottuk a legkedvezőbb predikciós jellemzőket mutató változó kombinációkat. Jellemző módon azt találtuk, hogy a leghatékonyabb prediktív kombinációk tartalmazzák az ismert klinikai prediktorokat (gyulladás, veseelégtelenség), azonban nem, vagy elvétve tartalamzzák az ezekkel kapcsolatos genetikai változékonyságot jelző polimorfizmusadatokat. 3, In vitro validálsái modellkísérleteket végeztünk az adatanalízissel megállapított prediktor kombinációk valós biológiai hatásainak elemzésére. Megállapítottuk, hogy önállóan, vagy kombinációban alkalmazva a kiváklasztott biomarkerek nem mutatnak kapcsolatot az endothel diszfunkció paramétereivel. | The following tasks were implemented within the framework of this project: 1, Clinical studies enrolling patients with chronic heart failure, pneumonia-associated sepsis, preeclampsia and colorectal cancer were planned and carried out. Several biomarkers, genetic markers and clinical data were measured or registered. Results of the project were published in multiple original artoicles in international peer-reviewed journals and formed the basis of PhD thesis and patent submission. In-depth statistical and mathematical analysis of study databases were also also done. 2, In collaboration with researchers at the ELTE Department of Operation research, amendement and testing of the logical analysis of data algorithm was done with real data. Analysing the results of the different runs variable patterns with good discriminating and predicting power were selected. Typically, the best marker combinations contained the well known clinical predictors in CHF, including markers of renal failure, infalmmation and vasoregulation. However, markers of genetic variability of these biomarkrs occured unlikely in the best patterns. 3, In validation experiments using endothelial cell cultures we aimed to show biological effects of the selected biomarker combinations. It was determined that the selected clinical biomarkers neither alone, nor in combination were able to induce endothelial disfunction

Evidence, detailed characterization and clinical context of complement activation in acute multisystem inflammatory syndrome in children

Multisystem inflammatory syndrome in children (MIS-C) is a rare, life-threatening complication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection. MIS-C develops with high fever, marked inflammation and shock-like picture several weeks after exposure to, or mild infection with SARS-CoV-2. Deep immune profiling identified activated macrophages, neutrophils, B-plasmablasts and CD8 + T cells as key determinants of pathogenesis together with multiple inflammatory markers. The disease rapidly responds to intravenous immunoglobulin (IVIG) treatment with clear changes of immune features. Here we present the results of a comprehensive analysis of the complement system in the context of MIS-C activity and describe characteristic changes during IVIG treatment. We show that activation markers of the classical, alternative and terminal pathways are highly elevated, that the activation is largely independent of anti-SARS-CoV-2 humoral immune response, but is strongly associated with markers of macrophage activation. Decrease of complement activation is closely associated with rapid improvement of MIS-C after IVIG treatment