Biogénesis de grupos Fe-S en plantas : estudios bioquímicos, estructurales y regulatorios de frataxinas de Arabidopsis thaliana y Zea mays

Los grupos Fe-S son pequeñas moléculas inorgánicas con capacidad redox que se encuentran entre los cofactores más antiguos de la naturaleza. Las proteínas con centros Fe-S están involucradas en las principales rutas metabólicas y se encuentran ampliamente distribuidas en los tres reinos de la vida. La biosíntesis de estas moléculas requiere de un proceso controlado debido a que los iones Fe+2 y S-2 en sus formas libres son tóxicos para la célula. En organismos eucariotas y procariotas existen varios complejos proteicos encargados de la biosíntesis de los grupos Fe-S en diferentes situaciones fisiológicas denominados sistemas NIF, SUF, ISC y CIA. El mecanismo básico para el ensamblado de los grupos Fe-S en todos estos sistemas se puede dividir en dos etapas: la unión del hierro y el azufre a una proteína molde y la transferencia del centro Fe-S a las apoproteínas blanco mediado por chaperonas con especificidad variable. A partir de estudios en células de mamíferos y levaduras, se postuló la participación de frataxina en el ensamblado de centros Fe-S, así como también en el metabolismo energético mitocondrial, respiración y homeostasis del hierro. Frataxina es una proteína mitocondrial y está altamente conservada desde bacterias hasta mamíferos y plantas, sin presentar mayores cambios estructurales. Esto sugiere que esta proteína cumpliría funciones similares en todos estos organismos. Las plantas poseen tres sistemas que conducen a la formación de grupos Fe-S: el sistema ISC en mitocondrias, la maquinaria SUF en cloroplastos y el sistema CIA en el citosol. Debido a esta compartimentación, y a que las proteínas involucradas se encuentran principalmente codificadas en el núcleo, la regulación y la comunicación en y entre los tres sistemas parecen ser complejas y en su gran mayoría desconocidas. AtFH (frataxina de Arabidopsis thaliana) es una proteína esencial para el desarrollo. Líneas de Arabidopsis con niveles reducidos de esta proteína presentan retardo en el desarrollo, alto contenido de hierro mitocondrial, aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno, menor contenido de hemo total y disminución en la actividad de hemoproteínas y de proteínas mitocondriales con centros Fe-S. AtFH tendría un rol importante en las mitocondrias de las plantas, participando en el almacenamiento de Fe biodisponible, en la atenuación del estrés oxidativo y en la formación de los grupos hemo y centros Fe-S. Además, actualmente se demostró que también está presente en cloroplastos. Recientemente, realizando una búsqueda en bases de datos de plantas de interés económico, encontramos que tanto maíz como soja y sorgo presentaban más de una isoforma de frataxina. En maíz identificamos dos genes que codificarían para diferentes frataxina en maíz. Con el fin de caracterizar las frataxinas de maíz, se expresaron y purificaron las versiones maduras de ZmFH42 y ZmFH55. Se realizó la caracterización bioquímica in vitro de las proteínas maduras y se comprobó su actividad in vivo mediante ensayos de complementación en levaduras knock out. También se estudió las propiedades de oligomerización de las mismas. El análisis de la secuencia primaria de ZmFH42 y ZmFH55 mostró que la región amino terminal presentan un posible péptido tránsito para el direccionamiento a mitocondria. Con el objetivo de determinar la localización subcelular de las mismas se generaron líneas de Arabidopsis que expresan una fusión del péptido tránsito predicho de ZmFH42 y ZmFH55 con la proteína fluorescente verde (EGFP). Los resultados obtenidos por microscopia confocal láser de fluorescencia demostraron que el péptido tránsito de las isoformas de maíz es capaz de direccionar EGFP tanto a mitocondrias como a cloroplastos. Además se determinaron los niveles de expresión de ambas isoformas en distintos tejidos de maíz. En trabajos previos en nuestro laboratorio se determinó el patrón de expresión de AtFH en diferentes estadios del desarrollo de Arabidopsis a partir de la construcción de fusiones transcripcionales de la secuencia promotora de AtFH a la secuencia codificante de la enzima β-glucuronidasa (GUS). La expresión de GUS se observó principalmente en tejidos meristemáticos, en granos polen y durante los primeros estadios del desarrollo de la semilla. Considerando que la presencia de algunos intrones pueden modificar los niveles de expresión de ciertos genes en plantas, entonces se estudió también el efecto del primer intrón de AtFH. Se determinó que la presencia de la secuencia correspondiente al primer intrón AtFH modifica notablemente la expresión de este gen. Los resultados anteriores indican AtFH se expresa en tejidos y órganos con un alto requerimiento energético, sugiriendo un rol importante para ambas proteínas en el metabolismo mitocondrial de Arabidopsis. Además se demostró que la secuencia promotora de AtFH contiene los elementos reguladores ABRE y RY que modulan la expresión génica, y que esta regulación está compartida con otro gen de la síntesis de centro Fe-S, la cisteína desulfurasa AtNfs1. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen a comprender mejor las funciones de los homólogos a frataxina en plantas superiores.Fil: Buchensky, Celeste. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI-CONICET); Argentina

JAM: Mitigating Jellyfish Attacks in Wireless Ad Hoc Networks

Trypanosoma cruzi, the etiologic agent for Chagas' disease, has requirements for several cofactors, one of which is heme. Because this organism is unable to synthesize heme, which serves as a prosthetic group for several heme proteins (including the respiratory chain complexes), it therefore must be acquired from the environment. Considering this deficiency, it is an open question as to how heme A, the essential cofactor for eukaryotic CcO enzymes, is acquired by this parasite. In the present work, we provide evidence for the presence and functionality of genes coding for heme O and heme A synthases, which catalyze the synthesis of heme O and its conversion into heme A, respectively. The functions of these T. cruzi proteins were evaluated using yeast complementation assays, and the mRNA levels of their respective genes were analyzed at the different T. cruzi life stages. It was observed that the amount of mRNA coding for these proteins changes during the parasite life cycle, suggesting that this variation could reflect different respiratory requirements in the different parasite life stages.Fil: Buchensky, Celeste. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Almirón, Paula. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Suarez Mantilla, Brian. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia; Brazil.Fil: Silber, Ariel M. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia; Brazil.Fil: Cricco, Julia Alejandra. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

SCARECROW‐LIKE28 modulates organ growth in Arabidopsis by controlling mitotic cell cycle exit, endoreplication, and cell expansion dynamics

The processes that contribute to plant organ morphogenesis are spatial-temporally organized. Within the meristem, mitosis produces new cells that subsequently engage in cell expansion and differentiation programs. The latter is frequently accompanied by endoreplication, being an alternative cell cycle that replicates the DNA without nuclear division, causing a stepwise increase in somatic ploidy. Here, we show that the Arabidopsis SCL28 transcription factor promotes organ growth by modulating cell expansion dynamics in both root and leaf cells. Gene expression studies indicated that SCL28 regulates members of the SIAMESE/SIAMESE-RELATED (SIM/SMR) family, encoding cyclin-dependent kinase inhibitors with a role in promoting mitotic cell cycle (MCC) exit and endoreplication, both in response to developmental and environmental cues. Consistent with this role, mutants in SCL28 displayed reduced endoreplication, both in roots and leaves. We also found evidence indicating that SCL28 co-expresses with and regulates genes related to the biogenesis, assembly, and remodeling of the cytoskeleton and cell wall. Our results suggest that SCL28 controls, not only cell proliferation as reported previously but also cell expansion and differentiation by promoting MCC exit and endoreplication and by modulating aspects of the biogenesis, assembly, and remodeling of the cytoskeleton and cell wall

The heme uptake process in Trypanosoma cruzi epimastigotes is inhibited by heme analogues and by inhibitors of ABC transporters

Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule involved in many biological reactions, including oxygen transport, respiration, photosynthesis and drug detoxification. Trypanosoma cruzi parasites, the etiological agent of Chagas’ disease, take up heme from the environment to supply their nutritional needs because they do not synthesize this cofactor. However, the mechanisms involved in heme transport across biological membranes are poorly understood. Indeed, in T. cruzi, no heme transporter has yet been characterized. In the present work, we evaluate the heme uptake processes by T. cruzi epimastigotes using fluorescent heme-analogues. Heme uptake decreased significantly when cells were pretreated with different concentrations of SnPPIX, PdMPIX or ZnMPIX, this observed competition suggests that they are taken up by the same transport system. We studied the growth behavior of epimastigotes using the same heme-analogues and the treatments with SnPPIX or PdMPIX impaired cell growth but when heme was added to the culture medium the observed inhibition was partially reversed. In addition, we tested how the heme uptake processes are affected by the presence of different transporter inhibitors. When the cells were treated with inhibitors and then incubated with heme, heme uptake decreased significantly for all treatments. These results constitute a strong indication for the existence of a protein associated with porphyrin transport in T. cruzi, possibly ATP-binding cassette transporters (ABC-transporter).Fil: Cupello Peixoto, Mauricio. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (IBRAG). Departamento de Bioquímica. Laboratório de Interação Tripanossomatídeos e Vetores; Brazil.Fil: Fernandes de Souza, Cíntia. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (IBRAG). Departamento de Bioquímica. Laboratório de Interação Tripanossomatídeos e Vetores; Brazil.Fil: Buchensky, Celeste. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Rocha Corrêa Soares, Juliana Baptista. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica. Programa de Biologia Molecular e Biotecnologia. Laboratório de Bioquímica Redox; BrazilFil: Travassos Laranja, Gustavo Augusto. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (IBRAG). Departamento de Bioquímica. Laboratório de Interação Tripanossomatídeos e Vetores; Brazil.Fil: Garcia Pinto Coelho, Marsen. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (IBRAG). Departamento de Bioquímica. Laboratório de Interação Tripanossomatídeos e Vetores; Brazil.Fil: Cricco, Julia Alejandra. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Química Biológica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina.Fil: Paes, Marcia Cristina. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (IBRAG). Departamento de Bioquímica. Laboratório de Interação Tripanossomatídeos e Vetores; Brazil.Fil: Paes, Marcia Cristina. Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia. Entomologia Molecular (INCT-EM); Brazi

SCARECROW-LIKE28 modulates organ growth in Arabidopsis by controlling mitotic cell cycle exit, endoreplication, and cell expansion dynamics

The processes that contribute to plant organ morphogenesis are spatial–temporally organized. Within the meristem, mitosis produces new cells that subsequently engage in cell expansion and differentiation programs. The latter is frequently accompanied by endoreplication, being an alternative cell cycle that replicates the DNA without nuclear division, causing a stepwise increase in somatic ploidy. Here, we show that the Arabidopsis SCL28 transcription factor promotes organ growth by modulating cell expansion dynamics in both root and leaf cells. Gene expression studies indicated that SCL28 regulates members of the SIAMESE/SIAMESE-RELATED (SIM/SMR) family, encoding cyclin-dependent kinase inhibitors with a role in promoting mitotic cell cycle (MCC) exit and endoreplication, both in response to developmental and environmental cues. Consistent with this role, mutants in SCL28 displayed reduced endoreplication, both in roots and leaves. We also found evidence indicating that SCL28 co-expresses with and regulates genes related to the biogenesis, assembly, and remodeling of the cytoskeleton and cell wall. Our results suggest that SCL28 controls, not only cell proliferation as reported previously but also cell expansion and differentiation by promoting MCC exit and endoreplication and by modulating aspects of the biogenesis, assembly, and remodeling of the cytoskeleton and cell wall.Fil: Goldy, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Barrera, Virginia Lis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Taylor, Isaiah. University of Duke; Estados UnidosFil: Buchensky, Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Vena, Rodrigo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Benfey, Philip N.. University of Duke; Estados UnidosFil: De Veylder, Lieven. University of Ghent; BélgicaFil: Rodriguez Virasoro, Ramiro Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Copper redox chemistry of plant frataxins

The presence of a conserved cysteine residue in the C-terminal amino acid sequences of plant frataxins differentiates these frataxins from those of other kingdoms and may be key in frataxin assembly and function. We report a full study on the ability of Arabidopsis (AtFH) and Zea mays (ZmFH-1 and ZmFH-2) frataxins to assemble into disulfide-bridged dimers by copper-driven oxidation and to revert to monomers by chemical reduction. We monitored the redox assembly-disassembly process by electrospray ionization mass spectrometry, electrophoresis, UV–Vis spectroscopy, and fluorescence measurements. We conclude that plant frataxins AtFH, ZmFH-1 and ZmFH-2 are oxidized by Cu2 + and exhibit redox cysteine monomer – cystine dimer interexchange. Interestingly, the tendency to interconvert is not the same for each protein. Through yeast phenotypic rescue experiments, we show that plant frataxins are important for plant survival under conditions of excess copper, indicating that these proteins might be involved in copper metabolism.Fil: Sánchez, Manu. Universidad de Granada; EspañaFil: Palacios, Oscar. Universitat Autònoma de Barcelona; EspañaFil: Buchensky, Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosinteticos y Bioquimicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.bioquímicas y Farmaceuticas. Centro de Estudios Fotosinteticos y Bioquimicos; ArgentinaFil: Sabio, Laura. Universidad de Granada; EspañaFil: Gomez Casati, Diego Fabian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosinteticos y Bioquimicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.bioquímicas y Farmaceuticas. Centro de Estudios Fotosinteticos y Bioquimicos; ArgentinaFil: Pagani, María Ayelén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosinteticos y Bioquimicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.bioquímicas y Farmaceuticas. Centro de Estudios Fotosinteticos y Bioquimicos; ArgentinaFil: Capdevila, Mercè. Universitat Autònoma de Barcelona; EspañaFil: Atrian, Silvia. Universidad de Barcelona; EspañaFil: Dominguez Vera, Jose M.. Universidad de Granada; Españ

Identification of two frataxin isoforms in Zea mays: Structural and functional studies

Frataxin is a ubiquitous protein that plays a role in Fe-S cluster biosynthesis and iron and heme metabolism, although its molecular functions are not entirely clear. In non-photosynthetic eukaryotes, frataxin is encoded by a single gene, and the protein localizes to mitochondria. Here we report the presence of two functional frataxin isoforms in Zea mays, ZmFH-1 and ZmFH-2. We confirmed our previous findings regarding plant frataxins: both proteins have dual localization in mitochondria and chloroplasts. Physiological, biochemical and biophysical studies show some differences in the expression pattern, protection against oxidants and in the aggregation state of both isoforms, suggesting that the two frataxin homologs would play similar but not identical roles in plant cell metabolism. In addition, two specific features of plant frataxins were evidenced: their ability to form dimers and their tendency to undergo conformational change under oxygen exposure.Fil: Buchensky, Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Sánchez, Manuel. Universidad de Granada; EspañaFil: Carrillo, Martin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Palacios, Oscar. Universitat Autònoma de Barcelona; EspañaFil: Capdevila, Mercè. Universitat Autònoma de Barcelona; EspañaFil: Domínguez Vera, Jose M.. Universidad de Granada; EspañaFil: Busi, María Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Atrian, Sílvia. Universidad de Barcelona. Facultad de Biología; EspañaFil: Pagani, María Ayelén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Gomez Casati, Diego Fabian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentin

Analysis of the presence of AtFH in isolated chloroplasts and mitochondria from <i>A</i>. <i>thaliana</i> by western blot in wt and <i>as-AtFH-1</i> plants.

<p>AtFH was detected using anti-AtFH antibodies. Anti-ADPGlc PPase and anti-NAD9 antibodies were used as controls to asses the purity of chloroplasts and mitochondria, respectively.</p

Subcellular localization of AtFH.

<p>The plasmid pZP212 containing the coding sequence of AtFH-GFP was introduced into Arabidopsis thaliana Col-0 plants by the floral dip method. Protoplasts were isolated from the resulting transgenic plants and analyzed by confocal microscopy. (A) Mitotracker staining showing mitochondria (excitation 543 nm/emission 576 nm); (B) GFP fluorescence (excitation 488 nm/emission 510 nm); (C) Chlorophyll autofluorescence (excitation 488 nm/emission 650 nm); (D) Overlay of A and B showing coincidence of GFP localization and Mitotracker (yellow); (E) Overlay of B and C showing the coincidence of GFP localization and chlorophyll autofluorescence (yellow); (F) Phase contrast image of the protoplast analyzed.</p

Photosynthetic parameters in <i>as-AtFH</i> and wt leaves.

<p>Fv/Fm, Maximum quantum yield of PSII; ϕ PSII, Quantum yield of PSII; qP, Photochemical quenching; NPQ, Non-photochemical quenching. Values are the mean ± standard deviation of at least three leaves from 10 individual plants.</p><p>Asterisks (*) indicate statistically different results (P < 0.05).</p><p>Photosynthetic parameters in <i>as-AtFH</i> and wt leaves.</p