Caracterización molecular de genes localizados en el Locus responsable de la apomixis (ACL) en Paspalum notatum

Paspalum notatum Flügge es una gramínea perenne rizomatosa ampliamente distribuida desde el centro-este de México e islas del Caribe hasta la Argentina. Las razas tetraploides se reproducen casi exclusivamente por apomixis de tipo apospórica. La apomixis en P. notatum está controlada por un locus simple dominante que presenta distorsión de la segregación y represión de la recombinación. El mismo se halla inserto en una región genómica de gran tamaño (apomixis controlling locus, ACL) que contiene secuencias codificantes, elementos repetitivos y metilación de citosinas consistentes con una región heterocromatinizada. Estudios de mapeo comparativo determinaron que un segmento de aproximadamente 5,8 cM del cromosoma 12 de arroz (comprendido entre los marcadores C1069 y C996) es sinténico al ACL en al menos cuatro especies del género Paspalum. Varias de las secuencias incluidas en este segmento muestran homologías con genes asociados a la señalización y el crecimiento (LOC_Os12g40770 - proteína con repeticiones de anquirina), el metabolismo de hormonas (LOC_Os12g40890 - proteína de la familia Aux/IAA de respuesta temprana a auxinas), y el desarrollo (LOC_Os12g41060 - proteína con dominio AP2). El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar las secuencias de P. notatum ortólogas a los genes localizados en el segmento de arroz sinténico al ACL, descriptas anteriormente, dado que por su anotación funcional podrían participar en alguno de los mecanismos de la reproducción en la especie. Una población de mapeo tipo F1 segregante por el modo de reproducción, desarrollada a partir del cruzamiento de una planta tetraploide completamente sexual (Q4188) (progenitor femenino) y un individuo natural apomíctico obligado (Q4117) (dador de polen), fue extendida a 50 individuos totales y reclasificada. La clasificación por el modo de reproducción a través de técnicas citoembriológicas y moleculares mostró 11 individuos apomícticos y 39 sexuales (relación 3,5 sex: 1 apo). La detección de secuencias de P. notatum similares a los genes de interés se llevó adelante utilizando un transcriptoma del desarrollo reproductivo sexual y apomíctico de la especie. El análisis del ligamiento de las secuencias identificadas con el ACL fue realizado mediante análisis BSA y posteriormente análisis de cosegregación utilizando la población de mapeo disponible. Asimismo, se realizó un mapeo físico sobre un borrador del genoma del citotipo diploide de la especie recientemente desarrollado en nuestro laboratorio. En primer lugar, se caracterizó el gen LOC_Os12g40770 codificante para una proteína con repeticiones de anquirina de la subfamilia ANK-TPR. A partir de búsquedas BLAST fue posible identificar cuatro miembros pertenecientes a la subfamilia ANK-TPR expresados durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Uno de estos, nombrado como PnANK-TPR3, presentó elevada homología con OsANK-TPR (codificada por LOC_Os12g40770). Los estudios de ligamiento no pudieron determinar la localización de PnANK-TPR3 en el ACL. Sin embargo, el mapeo in silico de PnANK-TPR3 sobre el borrador del genoma diploide de P. notatum, mostró que una secuencia altamente similar a esta última se posiciona en el supercontig utg001669l que contiene además una secuencia similar a la sonda heteróloga C1069, que mapea 100% ligada ACL en varias especies del género. Este resultado indica que PnANK TPR3 se localiza en el ACL. Estudios de expresión por PCR en tiempo real (qRT-PCR) en diferentes estadios del desarrollo reproductivo del genotipo Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico) mostraron que PnANK-TPR3 se sobreexpresa significativamente en los estadios de meiosis y antesis durante el desarrollo reproductivo sexual, comparado con el apomíctico. Los resultados para el estadio de meiosis fueron corroborados empleando seis individuos (tres sexuales y tres apomícticos) de la población F1 (Q4188 x Q4117). Esto indica que PnANK TPR3 está regulado negativamente al momento de la meiosis en los individuos apospóricos analizados. Sumado a esto, PnANK-TPR3 mostró muy bajos niveles de expresión en tejido somático (hoja y raíz). Por otro lado, se detectó una proteína quinesina como interactora directa de OsANK-TPR. Este tipo de proteínas juegan un papel fundamental en el control del ciclo celular. Los resultados obtenidos para PnANK-TPR3 indican que podría formar parte de una cascada de señalización involucrada en la determinación del destino de las células de la nucela y su posible canalización hacia la gametogénesis. Posteriormente, se caracterizó el gen relacionado al LOC_Os12g40890, codificante para una proteína miembro de la familia Aux/IAA de respuesta temprana a auxinas. A través de búsquedas BLAST se detectaron 22 miembros de dicha familia expresados durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Uno de estos miembros, renombrado como PnIAA30, mostró ser ortólogo a LOC_Os12g40890 (OsIAA30). Los análisis de ligamiento determinaron que una forma alélica de PnIAA30 se encuentra genéticamente ligada al ACL a una distancia de recombinación aproximada de r = 0,30. Sumado a esto, el mapeo in silico de PnIAA30 sobre el borrador del genoma diploide de P. notatum, mostró que una secuencia altamente similar a esta última se posiciona en el mismo supercontig (utg001669l) que las secuencias homólogas a PnANK-TPR3 y a la sonda heteróloga C1069 100% ligada al ACL de P. notatum. Esos resultados marcan una evidencia consistente de que PnIAA30 es el ortólogo de OsIAA30, está efectivamente localizado cerca del ACL y que su disposición génica, la de PnANK-TPR3 y el marcador C1069 en esta región de P. notatum, es colineal con la región del cromosoma 12 de arroz. Por otra parte, los estudios de expresión por qRT-PCR para PnIAA30 mostraron que los transcriptos de este gen están significativamente más expresados durante el desarrollo sexual (Q4188) que el apomíctico (Q4117) al momento de la antesis. Estos resultados se repitieron en cinco individuos (tres sexuales y dos apomícticos) de la población F1 (Q4188 x Q4117). Además, se observó que la expresión de PnIAA30 se asocia negativamente con el grado de expresividad de la aposporía, lo cual está en línea con la teoría del surgimiento de la apomixis como una desregulación en la expresión de los genes involucrados en la vía canónica sexual. Por otro lado, mediante experimentos RT-PCR se determinó que PnIAA30 presenta mayor expresión durante la embriogénesis en el genotipo sexual respecto del apomíctico. Este resultado sugiere que PnIAA30 podría estar relacionado al control del desarrollo del embrión sexual. Experimentos de hibridación in situ de tejidos, mostraron una expresión contrastante entre el genotipo sexual y el apomíctico. PnIAA30 parece estar activo en la CMM del genotipo apomíctico y se expresa fuertemente en la nucela de plantas sexuales. Esta expresión localizada, podría estar relacionada con una diferente regulación de los destinos celulares. En el estadio de antesis, los experimentos de hibridación in situ mostraron que PnIAA30 se sobreexpresa en la nucela, núcleos polares y aparato oosférico del megagametófito del genotipo sexual comparado con el apomíctico, donde la actividad de PnIAA30 es casi imperceptible. Estos últimos resultados señalan un posible rol de PnIAA30 en la señalización involucrada en la partenogénesis. Sumado a eso la red de proteínas interactoras de OsIAA30 determinó una relación directa con factores de transcripción ARFs (Auxin Response Factors) asociados a la megaesporogénesis de arroz, al igual que OsIAA30 ortólogo de PnIAA30. Por otro lado, se identificaron mediante búsquedas BLASTP, nueve proteínas miembros de la superfamilia AP2/ERF expresadas durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Cuatro de estas con elevada homología a miembros representativos del grupo de proteínas BBM (BABY BOOM) pertenecientes al clado euANT y cinco homólogas a miembros del clado euAP2 perteneciente a la familia AP2-like (APETALA2-LIKE). PnAP2-like, ortólogo putativo de APL25 (Oryza sativa) y SiAP2-like (Setaira itálica), presenta un alelo especifico del genotipo materno sexual que cosegrega ligado al modo reproductivo sexual. La identidad de los fragmentos de PnAP2-like amplificados sobre ADN genómico del genotipo sexual y apomíctico, arrojaron homología con una secuencia codificantes AP2-like de Setaria viridis, y dos secuencias TARGE OF EAT3 (TOE3) de Setaria italica y Panicum halli. Los genes TOE son reguladores postrancripcionales y parecen jugar un rol importante en la identidad de los órganos florales, junto a APETALA2 y AGAMOUS. PnBBM-like, mostró una representación posiblemente diferencial entre los transcriptomas de C4-4x (sexual) y Q4117 (apomíctico). El gen PsASGR-BABYBOOM-like fue asociado a la partenogénesis en Pennisetum glaucum (especie apospórica), por lo que podríamos pensar un posible rol de PnBBM-like en la partenogénesis de especies apospóricas como Paspalum notatum. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron detectar secuencias expresadas durante el desarrollo reproductivo de P. notatum, homólogas a genes correspondientes a la región del cromosoma 12 de arroz sinténica al ACL de la especie bajo estudio. Se detectaron los genes ortólogos de P. notatum y su localización en los genomas diploide y tetraploide. El mapeo in silico sobre el borrador del genoma diploide mostró una colinealidad entre las secuencias de P. notatum y de la región estudiada de arroz. Paralelamente, se pudo demostrar que tanto PnANK-TPR3 como PnIAA30 están regulados diferencialmente durante el desarrollo reproductivo sexual y apomíctico. Por otro lado, se determinó que un alelo de PnAP2-like cosegrega con la sexualidad y que PnBBM-like se encuentra regulado diferencialmente según la base global del transcripto del desarrollo reproductivo de P. notatum. Estos resultados aportan evidencia de que los genes relacionados con la señalización y el crecimiento celular, el metabolismo de hormonas y el desarrollo, localizados en el ACL, presentan una alteración en sus patrones de expresión durante el desarrollo sexual y apomíctico que probablemente derive de la estructura de dicha región genómica y se relacione con el cambio del modo reproductivo sexual al apomíctico.Paspalum notatum Flügge is a perennial rhizomatous grass distributed from Argentina to central Mexico and the Caribbean Island. The natural tetraploid cytotype reproduces by obligated aposporous apomixis. Apomixis in P. notatum is controlled by a single locus with distorted segregation ratio and suppression of recombination. This locus (apomixis controlling locus, ACL) is located in a large genomic region that includes coding sequences, repetitive elements, and cytosine methylation. Comparative mapping analysis identified a segment of approximately 5.8 cM of the rice chromosome 12 (between the C1069 and C996 markers) retained at the ACL of at least four species of the genus Paspalum. Several specific sequences from this rice segment show homology with genes associated with signaling and growth (LOC_Os12g40770 - protein with ankyrin repeats), hormone metabolism (LOC_Os12g40890 - Aux/IAA family), and development (LOC_Os12g41060 - protein with AP2 domain). The general objective of this work was to characterize P. notatum orthologous to those genes located in the rice segment synthetic to the ACL due to their functional annotation could be involved in some mechanisms controlling the reproduction mode of the species. An F1 mapping population segregating by the reproduction mode derived from a cross between a fully sexual tetraploid genotype (Q4188) and an obligate apomictic tetraploid pnat (Q4117) was classified according to the mode of reproduction. Thirty-nine plants were classified as sexual and 11 as apomictic (3,5:1 sexual: apomictic ratio) by molecular and cytoembryological analysis. The detection of P. notatum sequences similar to rice genes was carried out using transcriptomes of both sexual and apomictic reproductive developments of the species. Linkage analyses of the sequences with the ACL were performed by BSA analysis and cosegregation tests using the mapping population. Moreover, a physical mapping was carried out on a draft of the diploid genome of the species. First, we characterized the LOC_Os12g40770, coding for a protein with ankyrin repeats belong to ANK-TPR subfamily. Using BLAST searches four members from ANK-TPR subfamily expressed during reproductive development were detected. One of them, called as PnANK-TPR3, shows high homology with OsANK-TPR (encoded by LOC_Os12g40770). Mapping assays using the F1 population could not find a linkage of PnANK-TPR3 to ACL. However, in silico mapping of PnANK-TPR3 on the diploid genome showed a highly similar sequence positioned in the supercontig utg001669l, which also contains a sequence similar to the heterologous probe C1069, which maps 100% linked to the ACL in several species of the genus. This result indicates that PnANK-TPR3 is localized at the ACL and is the ortholog of OsANK-TPR. Expression analysis by qRT-PCR at different stages of the reproductive development of Q4188 (sexual) and Q4117 (apomictic) showed that PnANK-TPR3 is significantly overexpressed at meiosis and anthesis in the sexual genotype, compared to the apomictic one. The results obtained at the meiosis stage were corroborated using six individuals (three sexual and three apomictic) from the F1 population (Q4188 x Q4117). These results indicate that PnANK-TPR3 is negatively regulated at meiosis of the apomictic plants. Besides, the expression levels of PnANK-TPR3 in somatic tissues (leaf and root) were very low. Interestingly, a kinesin protein was detected to interact with whit OsANK-TPR. These proteins play an essential role in the control of the cell cycle. These results indicate that PnANK-TPR3 could be part of a signaling cascade involved in determining the fate of the nucellar cells and their possible switch towards gametogenesis. Subsequently, we characterized the LOC_Os12g40890 coding for a protein of the Aux/IAA family. Using BLAST searches, 22 members from the Aux/IAA family expressed during the reproductive development of P. notatum were detected. One of them, called as PnIAA30, shows orthology with OsIAA30 (encoded by LOC_Os12g40770). Mapping assays using the F1 population determined an allelic variant of PnIAA30 is genetically linked to 30 cM of the ACL. Moreover, in silico mapping of PnIAA30 on the diploid genome, showed a highly similar sequence to PnIAA30 positioned in the supercontig utg001669l as well as sequences homologous to PnANK-TPR3 and the heterologous probe C1069 100% linked to the ACL of P. notatum. These results support that PnIAA30 is the ortholog of OsIAA30 and it is located near the ACL. Also, the position of PnIAA30, PnANK-TPR3, and the marker C1069 in this region of P. notatum is collinear with the rice chromosome 12 region. On the other hand, expression analysis by qRT-PCR of PnIAA30 showed significant differences at the anthesis stage between sexual and apomictic genotypes. These results were observed also in five plants (three sexual and two apomictic) of the F1 population (Q4188 x Q4117). Moreover, we detected a negative correlation between PnIAA30 expression levels and the degree of expressiveness of the apospory, which would support the theory that apomixis results from the deregulation of the sexual developmental program. Besides, using RT-PCR analysis we detected high expression of PnIAA30 during embryogenesis of the sexual genotype respect apomictic one. This result suggests PnIAA30 could be related to the control of sexual embryo development. In situ hybridization of PnIAA30, showed a contrasting expression between the apomictic and sexual plants. The sense transcripts of PnIAA30 appears to be active in the CMM of the apomictic genotype and is strongly expressed in the nucellus of the sexual one. These results could be related to different regulation of cell fate surrounding the MMC. In situ hybridization with PnIAA30 at anthesis showed overexpression in the nucella, polar nuclei, and egg apparatus in the sexual megagametophyte compared to the apomictic one, where the activity of PnIAA30 is almost imperceptible. These results indicate a possible role of PnIAA30 in signaling during the parthenogenesis. In addition, we identified a direct relationship between OsIAA30 (ortholog of PnIAA30) and ARFs (Auxin Response Factors) transcription factors during the rice megasporogenesis. On the other hand, we identified nine members from the AP2/ERF superfamily expressed during reproductive development of P. notatum. Four of these transcripts showed high homology with representative members of the BBM protein coding group (BABY BOOM) belonging to the euANT clade. The remaining five, showed homologies to members of the clade euAP2 belonging to the AP2-like (APETALA2-Like) family. One of them called as PnAP2-like, putative orthologous of APL25 (Oryza sativa) and SiAP2-like (Setaira italica), presents a specific allele only present in the maternal sexual genotype that cosegregates linked to the sexual reproductive mode. The identity of the PnAP2-like fragments amplified from genomic DNA of the sexual and apomictic genotype showed homology with an AP2-like coding sequence from Setaria viridis, and with two TARGE OF EAT3 (TOE3) sequences from Setaria italica and Panicum halli. TOE genes are post-transcriptional regulators and appear to play an important role in the identity of floral organs along with APETALA2 and AGAMOUS genes. On the other hand, PnBBM-like showed a possibly differential representation between the C4-4x (sexual) and Q4117 (apomictic) transcriptomes. PsASGR-BABYBOOM-like gene was associated with parthenogenesis in Pennisetum glaucum (an aposporous species), so we could think of a possible role of PnBBM-like in the parthenogenesis of Paspalum notatum. The results obtained in this work allowed to detect sequences expressed during reproductive development of P. notatum that are homologous to genes located to the segment of the rice chromosome 12 syntenic to the ACL of the species. We detected the orthologous genes of P. notatum and their location on the diploid and tetraploid genomes. In silico mapping on the draft diploid genome showed conserved collinearity between the P. notatum and rice sequences of the region. At the same time, it could be shown that both PnANK-TPR3 and PnIAA30 are differentially regulated during sexual and apomictic reproductive development. On the other hand, it was determined that an allele of PnAP2-like cosegregates with sexuality, while PnBBM-like is differentially regulated between sexual and apomictic reproductive development of P. notatum. These results provide evidence that the genes associated with signaling and growth, hormone metabolism, and development located at the ACL present altered expression patterns between sexual and apomictic developments. This alteration probably derives from the structure of the ACL genomic region and is related to the switch from sexual to apomictic reproductive mode.Fil: Apellido, Nombre. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Azzaro, Celeste Antonela. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias ; Argentin

The Auxin-Response Repressor IAA30 Is Down-Regulated in Reproductive Tissues of Apomictic Paspalum notatum

International audienceThe capacity for apomixis in Paspalum notatum is controlled by a single-dominant genomic region, which shows strong synteny to a portion of rice chromosome 12 long arm. The locus LOC_Os12g40890, encoding the Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) family member OsIAA30, is located in this rice genomic segment. The objectives of this work were to identify transcripts coding for Aux/IAA proteins expressed in reproductive tissues of P. notatum, detect the OsIAA30 putative ortholog and analyze its temporal and spatial expression pattern in reproductive organs of sexual and apomictic plants. Thirty-three transcripts coding for AUX/IAA proteins were identified. Predicted protein alignment and phylogenetic analysis detected a highly similar sequence to OsIAA30 (named as PnIAA30) present in both sexual and apomictic samples. The expression assays of PnIAA30 showed a significant down-regulation in apomictic spikelets compared to sexual ones at the stages of anthesis and post-anthesis, representation levels negatively correlated with apospory expressivity and different localizations in sexual and apomictic ovules. Several PnIAA30 predicted interactors also appeared differentially regulated in the sexual and apomictic floral transcriptomes. Our results showed that an auxin-response repressor similar to OsIAA30 is down-regulated in apomictic spikelets of P. notatum and suggests a contrasting regulation of auxin signaling during sexual and asexual seed formation

Small rna-seq reveals novel regulatory components for apomixis in paspalum notatum

Background: Apomixis is considered an evolutionary deviation of the sexual reproductive pathway leading to the generation of clonal maternal progenies by seeds. Recent evidence from model and non-model species suggested that this trait could be modulated by epigenetic mechanisms involving small RNAs (sRNAs). Here we profiled floral sRNAs originated from apomictic and sexual Paspalum notatum genotypes in order to identify molecular pathways under epigenetic control that might be involved in the transition from sexuality to agamospermy. Results: The mining of genes participating in sRNA-directed pathways from floral Paspalum transcriptomic resources showed these routes are functional during reproductive development, with several members differentially expressed in apomictic and sexual plants. Triplicate floral sRNA libraries derived from apomictic and a sexual genotypes were characterized by using high-Throughput sequencing technology. EdgeR was apply to compare the number of sRNA reads between sexual and apomictic libraries that map over all Paspalum floral transcripts. A total of 1525 transcripts showed differential sRNA representation, including genes related to meiosis, plant hormone signaling, biomolecules transport, transcription control and cell cycle. Survey for miRNA precursors on transcriptome and genome references allowed the discovery of 124 entities, including 40 conserved and 8 novel ones. Fifty-six clusters were differentially represented in apomictic and sexual plants. All differentially expressed miRNAs were up-regulated in apomictic libraries but miR2275, which showed different family members with opposed representation. Examination of predicted miRNAs targets detected 374 potential candidates. Considering sRNA, miRNAs and target surveys together, 14 genes previously described as related with auxin metabolism, transport and signaling were detected, including AMINO ACID/AUXIN PERMEASE 15, IAA-AMIDO SYNTHETASE GH3-8, IAA30, miR160, miR167, miR164, miR319, ARF2, ARF8, ARF10, ARF12, AFB2, PROLIFERATING CELL FACTOR 6 and NITRATE TRANSPORTER 1.1. Conclusions: This work provides a comprehensive survey of the sRNA differential representation in flowers of sexual and apomictic Paspalum notatum plants. An integration of the small RNA profiling data presented here and previous transcriptomic information suggests that sRNA-mediated regulation of auxin pathways is pivotal in promoting apomixis. These results will underlie future functional characterization of the molecular components mediating the switch from sexuality to apomixis.Fil: Ortiz, Juan Pablo Amelio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Leblanc, Olivier. Université Montpellier II; FranciaFil: Rohr, Cristian Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Agrobiotecnología de Rosario; ArgentinaFil: Grisolía, Mauricio Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Agrobiotecnología de Rosario; ArgentinaFil: Siena, Lorena Adelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Podio, Maricel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Colono, Carolina Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Azzaro, Celeste Antonela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Pessino, Silvina Claudia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; Argentin

The MAP3K-Coding QUI-GON JINN (QGJ) gene is essential to the formation of unreduced embryo sacs in Paspalum.

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