Inestabilidad genética y cambios en la cromatina en mutantes del complejo THO en mitosis y meiosis de eucariotas modelo

Para el mantenimiento y el control de los procesos celulares, la integridad genética es un factor clave. Mutaciones o factores que alteren este control, conllevan a la inestabilidad del genoma, provocando defectos tanto a nivel celular como a nivel de organismo (Aguilera y Gómez-Gonzalez, 2008). Uno de los mecanismos clave para la integridad genética es la Transcripción, cuyos errores generan un incremento en las tasas de recombinación así como de mutación. THO es un complejo nuclear formado por 5 subunidades (Hpr1, Tho2, Mft1, Thp1, Tex1) que funcionan como una unidad estructural y funcional, juegando un papel clave en la biogénesis de las ribonucleopartículas, con una función principal llevada a cabo en la interfase entre la transcripción y el transporte del ARN mensajero (Strasser et al., 2002). El complejo THO se encuentra altamente conservado en eucariotas, aunque aún no había sido descrito en el nematodo C. elegans. En esta tesis hemos caracterizado una de las proteínas constituyentes del complejo THO en C.elegans, THOC-2, que posee un alto porcentaje de similaridad con Tho2 de levaduras y THOC-2 de humanos. Hemos observado que el complejo THO se encuentra conservado en el nematodo, siendo esencial para su desarrollo. Los mutantes THO son estériles, pero gracias a la contribución materna de ARNm mensajero en la descendencia, los nematodos mutantes THO llegan a desarrollarse hasta adultos, permitiendo estudiar la carencia de dicho complejo en tejidos adultos. Los mutantes THO, además de mostrar defectos en el desarrollo de la etapa adulta, muestra defectos en tejidos como la vulva o gónada. Estos tejidos son los únicos que continúan desarrollándose en el individuo adulto y requieren de una alta coordinación de la división celular, además de una alta tasa de división. Más concretamente, al estudiar el extremo distal de la línea germinal de C. elegans, donde los núcleos se dividen mitóticamente, hemos observado que la ausencia de un complejo THO funcional genera inestabilidad genética en mitosis y activa el checkpoint de replicación en dichos núcleos. Estos datos concuerdan con los resultados anteriormente publicados en levaduras (Gómez-Gónzalez et al., 2009)

Inestabilidad genética y cambios en la cromatina en mutantes del complejo Tho en mitosis y meiosis de eucariotas modelo

Trabajo realizado en el Departamento de Genética, Facultad de Biología, y en el Departamento de Biología Molecular, CABIMER, de la Universidad de Sevilla, para optar al grado de doctor en Biología por el licenciado Maikel Castellano Pozo.Para el mantenimiento y el control de los procesos celulares, la integridad genética es un factor clave. Mutaciones o factores que alteren este control, conllevan a la inestabilidad del genoma, provocando defectos tanto a nivel celular como a nivel de organismo (Aguilera y Gómez-Gonzalez, 2008). Uno de los mecanismos clave para la integridad genética es la Transcripción, cuyos errores generan un incremento en las tasas de recombinación así como de mutación. THO es un complejo nuclear formado por 5 subunidades (Hpr1, Tho2, Mft1, Thp1, Tex1) que funcionan como una unidad estructural y funcional, juegando un papel clave en la biogénesis de las ribonucleopartículas, con una función principal llevada a cabo en la interfase entre la transcripción y el transporte del ARN mensajero (Strasser et al., 2002). El complejo THO se encuentra altamente conservado en eucariotas, aunque aún no había sido descrito en el nematodo C. elegans. En esta tesis hemos caracterizado una de las proteínas constituyentes del complejo THO en C.elegans, THOC-2, que posee un alto porcentaje de similaridad con Tho2 de levaduras y THOC-2 de humanos. Hemos observado que el complejo THO se encuentra conservado en el nematodo, siendo esencial para su desarrollo. Los mutantes THO son estériles, pero gracias a la contribución materna de ARNm mensajero en la descendencia, los nematodos mutantes THO llegan a desarrollarse hasta adultos, permitiendo estudiar la carencia de dicho complejo en tejidos adultos. Los mutantes THO, además de mostrar defectos en el desarrollo de la etapa adulta, muestra defectos en tejidos como la vulva o gónada. Estos tejidos son los únicos que continúan desarrollándose en el individuo adulto y requieren de una alta coordinación de la división celular, además de una alta tasa de división. Más concretamente, al estudiar el extremo distal de la línea germinal de C. elegans, donde los núcleos se dividen mitóticamente, hemos observado que la ausencia de un complejo THO funcional genera inestabilidad genética en mitosis y activa el checkpoint de replicación en dichos núcleos. Estos datos concuerdan con los resultados anteriormente publicados en levaduras (Gómez-Gónzalez et al., 2009).La esterilidad de los mutantes THO en C.elegans, hizo que pensaramos en un posible papel de THO en el mantenimiento de la estabilidad genética durante meiosis. A través de la meiosis se generan los gametos o células sexuales, por lo que su correcto funcionamiento es vital para el mantenimiento del genoma a lo largo de generaciones. En la gónada del nematodo existe un punto de transición donde se produce la inducción de la meiosis. En los mutantes thoc-2, la meiosis no se llega a finalizar, lo cual explica el fenotipo de esterilidad. Para el correcto transcurso de la meiosis es necesario la producción de roturas de doble cadena del ADN (DSBs), dependientes de la endonucleasa SPO-11, necesarios para la formación de los quiasmas meióticos. En los mutantes thoc-2, hemos observado un incremento de DSBs independientes de SPO-11. Estos DSBs no llegan a ser reparados, dando como resultado un incremento de 4-5 veces de los niveles de cuerpos apoptóticos debido a la activación del control de ciclo celular. Para ver si estos fenotipos estaban conservados en otros organismos, extendimos nuestros análisis a la levadura S. cerevisiae, con los mutantes hpr1¿ de THO. Igualmente, se observaron marcadores de daño en el ADN, que dieron lugar a la activación del checkpoint mediado por Rad53, proteína que controla la respuesta a daños externos durante meiosis, que derivaba a un descenso en la viabilidad de las esporas. Específicamente se observó que la pre-replicación meiótica era defectuosa en ambos organismos, existiendo retrasos en el transcurso de dicha fase y afectando al resto del ciclo meiótico. Uno de los intermediarios descritos como responsables de la inestabilidad genética asociada a transcripción de los mutantes THO es la estructura denominada R-loop. Los R-loops se forman co-transcripcionalmente justo detrás del paso de la RNPII, entre el ARN mensajero naciente y la hebra molde de ADN, desplazando la hebra no molde de ADN como cadena sencilla (Aguilera y García-Muse, 2012). La mutación de cualquier subunidad del complejo THO impide que la ribonucleopartícula se ensamble correctamente, quedando el ARN mensajero naciente desnudo, lo cual permite que pueda aparear con la hebra de ADN transcrita y forme estructuras en R-loops. Varios estudios han demostrado el impacto que la formación de estructuras R-loops tienen en la inestabilidad genética durante mitosis (Huertas and Aguilera, 2003; Li and Manley, 2005).A través de la microinyección o sobreexpresión, en nematodos y levaduras respectivamente, de la enzima ARNasa H, que degrada específicamente el ARN de los híbridos ADN:ARN, observamos que la presencia de R-loops es parcialmente responsable de los defectos en la replicación meiótica, ya que se suprimieron parcialmente el retraso de la pre-replicación meiótica y activación del checkpoint celular en los mutantes THO. Durante la transcripción, la estructura de la cromatina supone un obstáculo para la RNPII. Existen modificaciones post-traduccionales de las histonas, constituyentes de los nucleosomas, que están asociadas con una transcripción activa, facilitando el paso de la RNPII. En mutantes del complejo THO, hemos visto que estas modificaciones no se encuentran alteradas. Por el contrario, existen modificaciones asociadas a genes o regiones inactivas, denominadas heterocromatina que dificultan la transcripción. Entre ellas, se encuentra la H3K9me2 o H3S10P. Las mutaciones de THO aumentan los niveles de cromatina inactiva y de condensación cromosómica. Especialmente llamativo fue el aumento de la fosforilación del residuo H3S10 durante mitosis y meiosis en levaduras, C. elegans o humanos. Esta fosforilación tambien tiene un papel en transcripción en interfase y sinergístico con las distintas acetilaciones que facilitan la transcripción. Su implicación en la condensación de la cromatina está relacionada con la segregación de los cromosomas (Hsu et al., 2000; Wei et al., 1999). Para estudiar si este fenómeno tiene algún efecto en la inestabilidad genética descrita para THO, hemos usado dos mutantes de la histona H3 donde la Serina10 ha sido sustituida por aspártico (H3S10D), mimético con el estado fosforilado de la serina y la sustitución por alanina (H3S10A), que no puede ser fosforilada, así como los dobles mutantes con hpr1¿. Dicha fosfrilación tiene un papel en el mantenimiento de la estabilidad genética, ya que la desregulación de la fosforilación de H3S10 genera inestabilidad genética, de manera independiente a su estado de fosforilación, al igual que es esencial en el mantenimiento de la estabilidad genética en un fondo mutante THO, suprimiéndose los fenotipos de hiper-recombinación de ambos mutantes H3S10 hpr1¿ respecto al mutante simple hpr1¿, así como la activación del checkpoint celular. Al analizar la distribución de la señal H3S10P a lo largo del genoma, se observó que ésta se encuentra asociada principalmente a centrómeros, regiones pericentroméricas y regiones transcritas. Además, el incremento de los niveles de H3S10P está ligado a la acumulación de R-loops en dichas zonas, ya que el mutante separador de función hpr1-101, que posee los defectos en elongación de la transcripción celular de hpr1¿ pero que no llega a formar estructuras R-loops, muestra un perfil silvestre de la fosforilación. Acorde con el papel en la condensación de la cromatina descrito para H3S10P, los mutantes THO muestran un incremento de los niveles de condensación del ADN. Por tanto, nuestro trabajo sugiere por primera vez un papel activo de los R-loops en la estructura de la cromatina que dan lugar a una condensación de la misma y una heterocromatinización, contribuyendo al silenciamiento transcripcional y a los defectos en la progresión de las horquillas de replicación como fuente de fragilidad cromosómica e inestabilidad genética previamente descritos.Peer Reviewe

The Caenorhabditis elegans THO Complex Is Required for the Mitotic Cell Cycle and Development

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License.THO is a conserved eukaryotic complex involved in mRNP biogenesis and RNA export that plays an important role in preventing transcription- and RNA-mediated genome instability in mitosis and meiosis. In mammals THO is essential for embryogenesis, which limits our capacity to analyze the physiological relevance of THO during development and in adult organisms. Using Caenorhabditis elegans as a model system we show that the THO complex is essential for mitotic genome integrity and the developmentally regulated mitotic cell cycles occurring during late postembryonic stages.This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Science and Innovation (BFU2010-16372 and Consolider Ingenio 2010 CSD2007-0015), the European Union (FEDER) and the Junta de Andalucía (CVI4567). MCP was the recipient of a predoctoral training fellowship from the Spanish National Institute of Health Carlos III.Peer reviewe

R‐loops cause replication impairment and genome instability during meiosis

R‐loops are harmful structures with a negative impact on transcription and recombination during mitosis, but no information exists for meiosis. We used Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans THO mutants as a tool to determine the consequences of R‐loops in meiosis. We found that both S. cerevisiae and C. elegans THO mutants show defective meiosis and an impairment of premeiotic replication as well as DNA‐damage accumulation. Importantly, RNase H partially suppressed the replication impairment and the DNA‐damage accumulation. We conclude that R‐loops can form during meiosis causing replication impairment with deleterious results.This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Science and Innovation (BFU2006‐05260, BFU2010‐16372 and Consolider Ingenio 2010 CSD2007‐0015), the European Union (FEDER) and the Junta de Andalucía (BIO102 and CVI4567).Peer reviewe

Chromosomal Instability in Genome Evolution: From Cancer to Macroevolution

The integrity of the genome is crucial for the survival of all living organisms. However, genomes need to adapt to survive certain pressures, and for this purpose use several mechanisms to diversify. Chromosomal instability (CIN) is one of the main mechanisms leading to the creation of genomic heterogeneity by altering the number of chromosomes and changing their structures. In this review, we will discuss the different chromosomal patterns and changes observed in speciation, in evolutional biology as well as during tumor progression. By nature, the human genome shows an induction of diversity during gametogenesis but as well during tumorigenesis that can conclude in drastic changes such as the whole genome doubling to more discrete changes as the complex chromosomal rearrangement chromothripsis. More importantly, changes observed during speciation are strikingly similar to the genomic evolution observed during tumor progression and resistance to therapy. The different origins of CIN will be treated as the importance of double-strand breaks (DSBs) or the consequences of micronuclei. We will also explain the mechanisms behind the controlled DSBs, and recombination of homologous chromosomes observed during meiosis, to explain how errors lead to similar patterns observed during tumorigenesis. Then, we will also list several diseases associated with CIN, resulting in fertility issues, miscarriage, rare genetic diseases, and cancer. Understanding better chromosomal instability as a whole is primordial for the understanding of mechanisms leading to tumor progression.V.C. is funded by the Spanish association against the Cancer AECC investigator grant (INVES20033COMA) and from the Fundación Vencer el Cancer. M.C.-P. and V.C. are funded by the MSCA IF grant coDNAres 101023902 (M.C.-P.) and Onco-inflammation 101026137 (V.C.)

R-loop dependent replication impairment and genome instability during meiosis

Póster presentado en EMBO Workshop on Recombination Mechanism and Genome Instability, celebrado en Jeréz de la Frontera (España) del 21 al 25 de mayo de 2012Peer Reviewe

Correction: The Caenorhabditis elegans THO Complex Is Required for the Mitotic Cell Cycle and Development.

[This corrects the article DOI: 10.1371/journal.pone.0052447.]