Determinación del efecto en cultivos celulares de la alteración de los niveles de MTCH1/PSAP mediante microscopía óptica multidimensional.

En este Proyecto estudiamos la proteína PSAP (presenilin 1-associated protein) también conocida como Mtch1 (mitocondrial carrier homolog 1) por su función proapoptótica y su posible relación con la enfermedad del Alzhéimer. Con la intención de determinar si la sobreexpresión o la reducción de los niveles de PSAP producían cambios en la proliferación, muerte o morfología celular, se cultivaron células HEK293T y HeLa modificadas genéticamente que sobreexpresan o expresan muy bajos niveles de PSAP. Se ha constatado que las células conservaban las características propias de su modificación genética, por medio de la realización de controles con antibióticos y por la técnica del western blot, que demostró que los niveles de sobreexpresión de PSAP eran los esperados tras la modificación de las células HEK293 e inducción de la expresión. Las células se tiñeron con distintos fluorocromos y se estudiaron utilizando un microscopio óptico multidimensional, que también puede realizar experimentos en célula viva, lo que permitió llevar a cabo estudios de viabilidad y morfología celular. En el experimento de viabilidad, se puso de manifiesto la actividad proapoptótica de PSAP tras añadir camptotecina pues la población que sobreexpresaba PSAP tenía la mayor tasa de mortalidad. Sin embargo, sin camptotecina, el crecimiento de esta población era similar al del resto de poblaciones con niveles de PSAP normales. Por otro lado, se vieron diferencias en cuanto a la morfología entre las células HEK293 con niveles de PSAP reducidos al 20% (HEK293-11C) y el resto de poblaciones. Estos resultados indican la importancia de las investigaciones de PSAP para estudiar las consecuencias de su inhibición y para entender en profundidad la vía apoptótica que implica a esta proteína

Papel de la autofagia en los procesos iniciales de agregación de alfa-sinucleína

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta al 1 % de la población de más de 65 años, lo que la convierte en la segunda enfermedad neurodegenerativa con mayor prevalencia del mundo. Se caracteriza por la pérdida de las neuronas dopaminérgicas en el sistema estriado de la substancia nigra y los cuerpos de Lewy, agregados proteicos citoplasmáticos que se componen mayoritariamente de α sinucleína (aSyn), una pequeña proteína altamente cargada que se expresa principalmente en neuronas. Todavía no se conocen con exactitud las funciones de la aSyn, pero los datos sugieren que participa en las conexiones sinápticas y la regulación de la síntesis de dopamina. Numerosos estudios relacionan, además, las alteraciones en el tráfico de vesículas con la EP, especialmente las que afectan a la autofagia, un mecanismo celular de degradación de componentes citosólicos infecciosos, disfuncionales o innecesarios. En el presente trabajo se utilizan modelos celulares para estudiar el papel de la autofagia en los procesos de agregación de aSyn. Para ello se emplearon dos variantes de la línea celular HAP 1: la variante silvestre y una deficiente en una proteína, ATG5, necesaria para la formación de la membrana de los autofagosomas. Mediante transfecciones transitorias se sobreexpresaron las proteínas aSyn, tau y p62, estando estas dos últimas implicadas en el transporte axonal y la autofagia selectiva, respectivamente. Se estudió la localización subcelular de las proteínas sobreexpresadas, así como su interacción mediante microscopía de fluorescencia, cross-linking y Western Blot. Se demostró la interacción de p62 con aSyn, pero no se evidenció la interacción entre tau y aSyn ni entre tau y p62. También se demostró la relación de la autofagia con la supervivencia de las células que sobreexpresan aSyn, aunque no se pudo detallar el proceso.<br /

Análisis funcional de moléculas bioactivas inductoras de muerte específica en células troncales

La investigación en células madre es esencial para su utilización en terapia celular y medicina regenerativa. Dos de los problemas que han surgido en este campo son la diferenciación a tipos celulares no deseados y la proliferación descontrolada de células indiferenciadas, dando lugar a la aparición de teratomas. La eliminación selectiva de células indiferenciadas podría prevenir la formación de tumores, y la eliminación de células diferenciadas podría ser útil para aislar células madre adultas a partir de tejidos. El objetivo del proyecto es la búsqueda de compuestos con toxicidad selectiva hacia células madre o hacia células diferenciadas. Se seleccionaron cuatro compuestos, y se analizó en más detalle el compuesto 1, que producía una mayor diferencia de viabilidad entre las líneas celulares estudiadas. Después de varios ensayos que indicaron que el compuesto 1 no producía los efectos esperados, se decidió utilizar otras técnicas para estudiar la viabilidad de células tratadas con el compuesto 1 o con cloruro de bencetonio, la citometría y la microscopía de fluorescencia en célula viva. Para ello se realizaron diversos ensayos de puesta a punto de la microscopía de célula viva,especialmente para evaluar la quimiotoxicidad y fototoxicidad de distintos fluorocromos. Los resultados obtenidos con las diversas técnicas utilizadas indicaron que el compuesto 1 no afecta a las células diferenciadas, mientras que aumenta ligeramente la viabilidad de las diferenciadas respecto a su control con DMSO. Los resultados con el cloruro de bencetonio corroboran los datos previos: provoca la muerte en células indiferenciadas, sin afectar a las células diferenciadas, pero con la novedad de hacerlo en cocultivo. Con ambos compuestos existen ligeras diferencias entre las diferentes técnicas utilizadas. Este trabajo ha servido para la puesta a punto en el laboratorio de la microscopía de fluorescencia en célula viva para llevar a cabo diversos estudios

Efecto de la sinucleína en la fisiología de células neuronales cultivadas en 3D en la enfermedad del Parkinson

La enfermedad del Parkinson (EP) es el trastorno neurológico degenerativo más común, después de la enfermedad del Alzheimer, cuya principal característica anatomopatológica es la presencia de agregados de α-sinucleína (aSyn), una proteína intrínsecamente desordenada presináptica, que desencadenará en la formación de fibrillas dando lugar a los cuerpos de Lewy (CL). La etiología y mecanismos patogénicos de la EP siguen sin comprenderse. Por tal motivo, resulta importante mejorar su conocimiento a partir de ensayos in vitro. Dado que las neuronas dopaminérgicas humanas son difíciles de obtener y mantener como células primarias, la investigación se realiza con modelos de células neuronales establecidos, como la línea celular SH-SY5Y. Las plataformas para cultivo celular bidimensional no recapitulan eficazmente los requerimientos espaciales esenciales para la organización e interacciones celulares que ocurren entre las células in vivo. La limitación del contacto célula-célula y la alteración de la señalización celular que ocurren in vitro puede resultar en grandes discrepancias entre la información obtenida en investigaciones in vivo e in vitro. Por tanto, el desarrollo de andamios tridimensionales puede facilitar el crecimiento celular en un macro y microambiente adecuados. En el presente trabajo, se procura comparar los resultados obtenidos en base a la diferenciación y comportamiento de la línea modelo en el cultivo en monocapa y tridimensional para determinar las condiciones óptimas de crecimiento de las SH-SY5Y cultivadas en 3D. Así, para ello, se cultiva la línea en dispositivos, como chips de microfluídica y µ-slides, que permiten el estudio del efecto en la viabilidad, diferenciación y contactos célula-célula de la adición de fibras de α-sinucleína. Esto posibilita que las células se comporten de la manera en que lo harían en la porción compacta de la sustancia negra (SNpc) del mesencéfalo pudiendo determinar así, los efectos de la adición α-sinucleína de forma similar a la que ocurre in vivo. <br /

Estudio del papel en la proliferación celular y en el metabolismo celular de la isoforma mitocondrial de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK-M) mediante edición genómica con CRISPR-Cas9

La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es una proteína clave del metabolismo celular al catalizar la reacción limitante de la gluconeogénesis. Cuenta con dos isoformas, citosólica y mitocondrial. El papel de esta última en el organismo no se conoce todavía en profundidad, por lo que su estudio resulta muy interesante. Una aproximación adecuada para tratar de elucidar su función es silenciarla mediante la técnica CRISPR-Cas9, una potente y novedosa herramienta de edición genética, dirigida específicamente a producir una deleción en el primer exón del gen que codifica para la proteína. Por una parte, los resultados muestran que la eficiencia de la técnica no ha sido muy buena, ya que de todos los clones seleccionados, solo dos muestran evidencias de deleción. Por otra parte, los efectos fenotípicos observados en el metabolismo no son muy significativos, al no haber grandes diferencias en la producción de glucosa en los clones silenciados con respecto al silvestre. Asimismo, no ha sido posible correlacionar el silenciamiento de la proteína con una proliferación celular alterada, ya que los clones positivos han resultado ser de crecimiento tanto rápido como lento, del mismo modo que clones negativos tenían bien crecimiento rápido, bien lento

Papel en la regulación del metabolismo intermediario de la isoforma citosólica de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) mediante edición genómica con CRISPR‐Cas9

La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) es una enzima que cataliza la descarboxilación de oxalacetato en fosfoenolpiruvato y presenta un papel clave en la ruta de la gluconeogénesis. Se han descrito 2 isoformas, la mitocondrial (PEPCK-M) y la citosólica (PEPCK-C); esta última se encuentra codificada en humanos por el gen Pck1. La PEPCK-C se expresa principalmente en hígado, riñón y tejido adiposo y tiene relevancia en enfermedades como la obesidad o la diabetes de tipo II. Con el fin de llevar a cabo un estudio funcional controlado del gen Pck1, se ha realizado un knock-out en la línea celular HEK293T de riñón embrionario humano empleando CRISPR/Cas9, una técnica de modificación genética precisa y novedosa que ha permitido producir un corte en el ADN dirigido específicamente contra el inicio de la traducción del gen Pck1. La deleción se analizó por PCR y por secuenciación, observándose 3 clones silenciados. Para comprobar si el knock-out producía la inhibición de la expresión de PEPCK-C se realizó un Western Blot, que sugirió la producción de un silenciamiento parcial, con una expresión disminuida. Por último, se comprobó que al transfectar en los clones silenciados un plásmido con la secuencia del gen se producía la reversión del silenciamiento en los 3 casos. Este trabajo abre la posibilidad de estudiar la función de la PEPCK-C en el metabolismo, determinando así su papel en distintos tejidos y en las enfermedades en las que interviene

Estudio de las interacciones entre proteínas anti- y proapoptóticas de la familia Bcl-2 en células vivas mediante BiFC

La proteína PUMA ha sido propuesta como un importante regulador en la vía mitocondrial de la apoptosis. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual PUMA y otras proteínas sólo-BH3 regulan la apoptosis, especialmente cómo activan a las proteínas Bax y Bak, es todavía controvertido. Estudios previos han analizado las interacciones entre proteínas de la familia Bcl-2 in vitro. En este estudio, mediante la técnica BiFC, fuimos capaces de crear dos líneas celulares estables de HeLa con PUMA y Bcl-xL y con PUMA y Mcl-1 con el fin de investigar las interacciones entre estas proteínas apoptóticas y antiapoptóticas directamente en células humanas vivas. Nuestros resultados indican que estas interacciones también se producen en células vivas, siendo más fuerte la interacción entre PUMA y Bcl-xL que entre PUMA y Mcl-1

Caracterización funcional de AIFM3 (Apoptosis-inducing factor mitochondrion-associated 3) mediante inactivación del gen por la técnica CRISPR-Cas9 y sobreexpresión de la proteína en bacterias y células eucariotas

El factor inductor de apoptosis homólogo a AIF (AIFL) es un miembro de la familia de proteínas AIF (factor inductor de apoptosis) del que se posee escasa información tanto a nivel estructural como funcional. Con el objeto de estudiar la función de esta proteína se generó una línea celular humana KO para el gen que la codifica, aifm3, por medio de la técnica de edición genómica CRIPSR/Cas9. La expresión ubicua del factor sugiere una posible función esencial en la célula, que se vio sustentada por la observación de un crecimiento significativamente ralentizado en la línea celular silenciada. En paralelo, se estudió la hipotética función pro-apoptótica del factor, diseñando vectores de expresión tanto para células procariotas como eucariotas con el fin de sobreexpresar el gen aifm3 en Escherichia coli y en la línea celular humana HEK293T. La sobreexpresión en bacterias se demostró mediante Western Blot, mientras que no se observó expresión ni efectos significantes en las células humanas transfectadas. La optimización de la expresión en bacterias permitirá, en estudios posteriores, diseñar un protocolo de purificación para su caracterización tanto bioquímica (mediante ensayos cinéticos) como estructural (por técnicas de cristalización)

Benzbromarone, Quercetin, and Folic Acid Inhibit Amylin Aggregation

Human Amylin, or islet amyloid polypeptide (hIAPP), is a small hormone secreted by pancreatic-cells that forms aggregates under insulin deficiency metabolic conditions, and it constitutes a pathological hallmark of type II diabetes mellitus. In type II diabetes patients, amylin is abnormally increased, self-assembled into amyloid aggregates, and ultimately contributes to the apoptotic death of -cells by mechanisms that are not completely understood. We have screened a library of approved drugs in order to identify inhibitors of amylin aggregation that could be used as tools to investigate the role of amylin aggregation in type II diabetes or as therapeutics in order to reduce -cell damage. Interestingly, three of the compounds analyzed-benzbromarone, quercetin, and folic acid-are able to slow down amylin fiber formation according to Thioflavin T binding, turbidimetry, and Transmission Electron Microscopy assays. In addition to the in vitro assays, we have tested the effect of these compounds in an amyloid toxicity cell culture model and we have found that one of them, quercetin, has the ability to partly protect cultured pancreatic insulinoma cells from the cytotoxic effect of amylin. Our data suggests that quercetin can contribute to reduce oxidative damage in pancreatic insulinoma cells by modulating the aggregation propensity of amylin

Identificación de los sitios de inicio de la transcripción y elaboración del mapa de transcripción del genoma mitocrondrial de "Artemia franciscana"

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 13-12-199