Obtenção de perfil protéico bidimensional de nódulos de Phaseolus vulgaris induzidos pro Rhizobium sp. NGR234 e pela estirpe nopJ-

Orientador: Roseli WassemMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : O cultivo de leguminosas de interesse agrícola depende de associações simbióticas com microorganismos capazes de fixar nitrogênio atmosférico, chamados rizóbios. O cultivo de feijão no Brasil apresenta uma produtividade média baixa, com amplitude de variação muito alta: desde 400 kg/ha até mais de 3000 kg/ha. Além disso, é essencialmente dependente de fertilizantes nitrogenados químicos, cuja fabricação demanda um alto custo. Considerando que o feijão constitui importante fonte de proteína da alimentação humana, principalmente em países pobres da África e América do Sul, é notável a importância do desenvolvimento de tecnologias de baixo custo que aumentem a produtividade e não causem prejuízos ao meio ambiente. O uso de inoculantes microbianos no cultivo de soja aproxima-se de 100% e representa uma economia anual de 8 bilhões de reais por ano no Brasil com fertilizantes químicos. No entanto, em outras leguminosas o uso de inoculantes ainda é limitado, devido ao desconhecimento dos fatores importantes para o estabelecimento de uma interação eficiente. O feijão comum (Phaseolus vulgaris) é colonizado pelo Rhizobium sp. NGR234, em um processo que envolve a ação sincronizada de genes de nodulação, fixação de nitrogênio e do sistema de secreção do tipo III (T3SS). NopJ é uma proteína efetora secretada pelo T3SS em NGR234 e é diretamente injetada no citoplasma da célula vegetal, mas sua função ainda é descohecida. Curiosamente, uma estirpe mutante nopJnodula o Phaseolus mais eficientemente que a estirpe selvagem. A fim de entender o efeito do NopJ na interação entre Rhizobium sp. NGR234 e P. vulgaris, foram cultivados feijões sob condições estéreis e inoculados com as estirpes selvagem e nopJde NGR234. Os nódulos foram coletados 4 e 6 semanas após a inoculação. Extratos protéicos foram obtidos para análises em géis de eletroforese bidimendional, utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado e SDS-PAGE. Os géis foram corados com Coomassie Blue G-250, e os perfis protéicos analisados. A posterior identificação das proteínas através de MALDI-TOF, irá contribuir com a elucidação dos mecanismos de interação entre Rhizobium-Phaseolus

Candida albicans PROTEIN PROFILE CHANGES IN RESPONSE TO THE BUTANOLIC EXTRACT OF Sapindus saponariaL.

Candida albicans is an opportunistic human pathogen that is capable of causing superficial and systemic infections in immunocompromised patients. Extracts of Sapindus saponaria have been used as antimicrobial agents against various organisms. In the present study, we used a combination of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to identify the changes in protein abundance of C. albicans after exposure to the minimal inhibitory concentration (MIC) and sub-minimal inhibitory concentration (sub-MIC) of the butanolic extract (BUTE) of S. saponaria and also to fluconazole. A total of six different proteins with greater than 1.5 fold induction or repression relative to the untreated control cells were identified among the three treatments. In general, proteins/enzymes involved with the glycolysis (GPM1, ENO1, FBA1), amino acid metabolism (ILV5, PDC11) and protein synthesis (ASC1) pathways were detected. In conclusion, our findings reveal antifungal-induced changes in protein abundance of C. albicans. By using the previously identified components of the BUTE of S. saponaria(e.g., saponins and sesquiterpene oligoglycosides), it will be possible to compare the behavior of compounds with unknown mechanisms of action, and this knowledge will help to focus the subsequent biochemical work aimed at defining the effects of these compounds

Análise proteômica e metabolômica de Azospirillum brasilense FP2 e seu mutante ntrC em condinções de alto e baixo amônio

Orientador: Emanuel Maltempi de SouzaCoorientador: Glaucio ValdameriTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 17/12/2018Inclui referênciasResumo: O gênero Azospirillum inclui microrganismos de vida livre capazes de colonizar e promover o crescimento de gramíneas e cereais, como milho, sorgo, trigo, arroz e aveia. O Azospirillum é capaz de fixar nitrogênio e se associar às raízes dessas plantas, podendo transferir parte do nitrogênio fixado ao vegetal (aproximadamente 10% das necessidades da planta). Dentre as 16 espécies descritas para o gênero, Azospirillum brasilense é a mais estudada. O sistema ntr regula o metabolismo de nitrogênio em A. brasilense, incluindo os genes responsáveis pela fixação. Esse sistema é composto pelas proteínas codificadas pelos genes glnD, glnB, glnZ, ntrB e ntrC. A proteína GlnD é capaz de sensoriar a glutamina intracelular e agir como uridililtransferase (Utase/UR) em resposta aos níveis de nitrogênio. Em condições de limitação de nitrogênio, GlnD adiciona grupos uridilil (UMP) às proteínas PII, GlnB e GlnZ, na preseça de ATP e 2-oxoglutarato. GlnB uridililada não interage com a histidina kinase NtrB, que, na sua forma livre, fosforila NtrC. NtrC ativa a transcrição de genes em resposta aos níveis de nitrogênio de maneira dependente de sigma 54 (RpoN). NtrB e NtrC compõem um sistema de dois componentes, no qual NtrB é capaz de fosforilar NtrC quando o nitrogênio intracelular é baixo. Por outro lado, a presença de nitrogênio resulta na defosforilação e consequente inativação de NtrC. O regulon NtrC já foi estabelecido em estudos anteriores para diversos organismos, incluindo Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti e Pseudomonas putida. Esses estudos mostraram a função global regulatória de NtrC nesses organismos e sugerem que esse ativador está envolvido na expressão de genes relacionados a transporte e catabolismo de compostos nitrogenados, assim como na regulação central de redes metabólicas. Em A. brasilense, NtrC atua como ativador transcricional de glnBglnA, glnZ e outros operons envolvidos em assimilação de nitrogênio. Em baixo nitrogênio, a transcrição de glnB aumenta em cinco vezes através da ação de NtrC e de maneira dependente do promotor sigma 54 de glnB. Além disso, GlnB é capaz de modular sua própria expressão, uma vez que controla a atividade de NtrB e, consequentemente, NtrC. GlnB uridililada é essencial para a atividade de NifA, ativador trancricional dos genes nif. Essa regulação é independente de NtrC, pois mutantes ntrC são capazes de fixar nitrogênio. NtrC também regula glnZ, que tem sua expressão aumentada sob limitação de nitrogênio. Em A. brasilense, GlnZ não está envolvido na atividade de NtrB-NtrC, contrário ao que ocorre em E. coli. O metabolismo geral do nitrogênio em A. brasilense compreende uma cascata complexa e não totalmente elucidada. O objetivo deste trabalho é utilizar uma abordagem proteômica e metabolômica para avaliar a resposta de A. brasilense FP2 e seu mutante ntrC cultivados em baixo e alto amônio, a fim de elucidar possíveis novos alvos de NtrC. Foi possível obter uma lista de proteínas que respondem ao baixo amônio na estirpe selvagem e mutante, possibilitando uma melhor compreensão da regulação do metabolismo de nitrogênio nesse organismo e também definir novos alvos de NtrC. Foi sugerida a participação de NtrC na resposta a estresse oxidativo e na capacidade de promoção de crescimento em plantas, especialmente para os parâmetros relacionados à raíz. Palavras-chave: Azospirillum brasilense. PII. Sistema ntr. Nitrogênio. NtrC. FP2.Abstract: The Azospirillum genus includes free-living microrganisms able to colonize and promote the growth of important cereals and grasses, such as maize, sorghum, wheat, rice and oat. Azospirillum is able to fix nitrogen in association with plant roots and transfer to plant part of the N fixed (about 10% of the plant needs). Among 16 Azospirillum species described, Azospirillum brasilense is the most studied. The ntr system regulates nitrogen metabolism in A. brasilense, including nitrogen fixation. This system is composed of the proteins encoded by the genes glnD, glnB, glnZ, ntrB and ntrC. The GlnD protein is able to sense intracellular glutamine and acts as an uridylyltransferase/uridylyl-removing enzyme (UTase/UR) in response to nitrogen levels. Under limiting nitrogen conditions, GlnD adds uridylyl groups (UMP) to the PII proteins, GlnB and GlnZ, in the presence of ATP and 2-oxoglutarate. Uridylylated GlnB cannot interact with the histidine kinase NtrB, which, in its free form, is able to phosphorylate NtrC. NtrC is an enhancer binding protein that controls the transcription of nitrogen regulated promoters, in a sigma 54 (RpoN) factor dependent manner. NtrB and NtrC compose a two-component system in which NtrB is capable of phosphorylating NtrC when nitrogen levels are low. On the other hand, the presence of nitrogen results in dephosphorylation and subsequent inactivation of NtrC. Previous studies defined the NtrC regulon for a number of organisms, including Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti and Pseudomonas putida. These studies showed the global regulatory function of NtrC in these organisms and suggested that NtrC is involved in the expression of genes related to transport and catabolism of nitrogen compounds, as well as regulation of central metabolic networks. In Azospirillum brasilense, NtrC acts as a transcriptional activator of glnBglnA, glnZ and other operons involved in nitrogen assimilation. In a nitrogen limiting condition, transcription of glnB increased five-fold mediated by the action of phosphorylated NtrC acting at the glnB sigma 54 factor dependent promoter, thus GlnB is able to regulate its own expression, since it controls the activity of NtrB and, consequently, NtrC. Uridylylated GlnB is essential for the activity of NifA, the transcriptional activator of nif genes. This regulation is independent of NtrC, as evidenced by the fact that ntrC mutants are able to fix nitrogen. NtrC also regulates glnZ and its expression is increased under limiting nitrogen. In A. brasilense, GlnZ was not found to be involved in the activity of NtrB-NtrC, in contrast to what occurs in E. coli. The general nitrogen metabolism in A. brasilense comprises a complex and yet not fully elucidated regulatory cascade. The aim of this work was to contrast the proteomic and metabolomic responses in A. brasilense FP2 and its ntrC mutant when grown in high and low nitrogen. The goal was to better understand the nitrogen metabolism regulation in this organism and to also find new targets for the transcriptional activator NtrC. It was determined a list of proteins that respond the low ammonium condition in the wild type and in the mutant, leading to a better understanding of the nitrogen metabolism regulation in this organism and also define new targets for NtrC. It was suggested that NtrC participates in the oxidative stress response and in the ability to promote plant growth, especially for the parameters related to the root