Study of the PN_TGS1 function in plant reproductive development

Paspalum notatum es una gramínea modelo utilizada para estudiar la apomixis, un tipo de reproducción asexual por semillas que permite la formación de progenies clonales idénticas a la planta madre. En trabajos anteriores nuestro grupo determinó que el gen PN_TGS1-like (similar a TRIMETILGUANOSINA SINTASA 1) se expresa en óvulos de plantas sexuales de P. notatum, pero está reprimido en plantas apomícticas. TGS1 codifica una metiltransferasa con rol dual, que promueve la biogénesis de sn(o) ARNs trimetilados en el proceso de splicing, y actúa como coactivador transcripcional. La eliminación de su función produce pérdida de la estructura nucleolar y deficiencias en el procesamiento de pre-rARNs y mARNs. Mientras que en levaduras y animales existe una sola copia del gen (TGS1), en plantas se detectan dos (TGS1 y TGS1-like). En P. notatum, la expresión de la copia exclusiva de plantas (TGS1-like) se correlaciona negativamente con la expresividad de la apomixis. Nuestro objetivo fue estudiar el rol de TGS1-like en el desarrollo reproductivo de la especie apomíctica apospórica P. notatum. Para ello, caracterizamos la estructura genómica y las variantes de expresión del gen, usando bases de datos construidas en nuestro laboratorio, y determinamos que existe una sola copia genómica del mismo, que muestra dos variantes de transcriptos florales. Luego, transformamos callos indiferenciados de una planta sexual con una construcción antisentido (pAct1-F1as) que silencia específicamente a TGS1-like. Las plantas antisentido desarrollaron tricomas en la superficie adaxial de la hoja y formación ocasional de óvulos gemelos. El análisis del desarrollo reproductivo en la antesis reveló que las líneas antisentido presentaban un 12,93-15,79% de los óvulos con sacos embrionarios de tipo apospórico (similares a SEA), y un 8,42-9,52% con una combinación de sacos meióticos y apospóricos. Además, en premeiosis/meiosis, el 32,5% de los óvulos mostraban células similares a iniciales de la aposporía (IAs) rodeando a la célula madre de la megáspora (CMM) o a las díadas meióticas derivadas de CMM. Estas IAs no iniciaban divisiones meióticas, por lo que podría inferirse que los sacos embrionarios supernumerarios detectados en antesis eran de tipo “no reducidos”. Las líneas antisentido producían una cantidad de polen y un conjunto de semillas viables equivalentes a las controles después de la autopolinización. Los análisis de citometría de flujo en cariopses derivados de líneas antisentido revelaron que todas las semillas viables se habían originado por sexualidad. Además, al comparar las líneas antisentido con los controles, detectamos una reducción de un 25,55% en el porcentaje de germinación. Para analizar si TGS1-like afectaba al proceso de clivado y empalme, comenzamos por seleccionar en nuestras bases transcriptómicas (454/Roche FLX +) los 316 transcriptos con mayor expresión diferencial en flores de plantas apomícticas y sexuales (nótese que ambos tipos de plantas expresan diferencialmente al gen TGS1-like en flores) (FDR < 6,74E-10). Luego analizamos cuáles de estos transcriptos diferenciales podrían corresponder a posibles variantes de splicing. Así, detectamos que una variante de splicing de CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1B-21 (CHLORO, isotig 23387) presentaba menor representación en el transcriptoma de plantas apomícticas con respecto a sexuales. La expresión diferencial de dicha variante de splicing fue validada en varios individuos con diferente modo de reproducción mediante qRT-PCR. Además, un análisis del procesamiento de CHLORO en las líneas antisentido tgs1-like confirmó que la expresión de esa misma variante de splicing está disminuida respecto a los controles, lo que confirma que la actividad de TGS1-like es necesaria para su formación. A partir de estos resultados, concluimos que CHLORO es uno de los blancos de TGS1-like. Además, identificamos un grupo numeroso de transcriptos relacionados con el splicing, que están diferencialmente representados en órganos reproductivos de plantas de P. notatum, y determinamos que conforman una red de interacciones junto con TGS1-like. En conjunto, nuestros resultados sugieren que, durante el proceso de reproducción sexual, TGS1-like se expresa en la nucela del óvulo e inhibe la formación de sacos embrionarios múltiples. La inhabilitación de la función TGS1-like provoca la aparición de células similares a IAs en la nucela, y luego sacos embrionarios supernumerarios, con morfología similar a los sacos embrionarios apospóricos, y posiblemente no reducidos. Sin embargo, la desregulación de PN_TGS1 no es suficiente para inducir la formación de progenie materna, ya que estos gametofitos extra no son capaces de llevar a cabo la partenogénesis y/o desarrollar endospermo viable. Además, la desregulación de PN_TGS1-like está asociada a defectos en la germinación de las semillas, aún de aquellas formadas por sexualidad, por lo que no descartamos un rol durante la embriogénesis y/o el desarrollo del endospermo. La regulación ejercida por PN_TGS1-like en la nucela del óvulo está enmarcada (al menos parcialmente) en un control del proceso de clivado y empalme, siendo la proteína cloroplástica de codificación nuclear CHLORO uno de sus genes blanco. Por otra parte, varios otros genes relacionados con la actividad de la maquinaria de splicing muestran una actividad diferencial durante la apomixis, y podrían integrar una red de interacciones funcionales junto con TGS1-like. En trabajos futuros deberán identificarse las relaciones funcionales entre los miembros de dicha malla, así como también la correspondencia entre el control ejercido por TGS1 sobre el cloroplasto y el splicing.Paspalum notatum is a grass model used to study apomixis. In previous work we determined that PN_TGS1-like (TRIMETILGUANOSINE SYNTHASE 1-like) is repressed in ovules of apomictic P. notatum plants. TGS1 encodes a RNA methyltransferase, which promotes the biogenesis of trimethylated sn (o) RNAs necessary for RNA splicing and acts as a transcriptional coactivator. TGS1 downregulation causes loss of nucleolar structure and deficiencies in pre-rRNAs and mRNAs processing. In yeasts and animals there is only one copy of TGS1, but two copies are detected in plants (TGS1 and TGS1-like). In P. notatum, the expression of the plant-specific copy (TGS1-like) negatively correlates with expressivity of apomixis. Our objective was to study the role of TGS1-like in the P. notatum reproductive development. First, we determined that Paspalum has a single genomic copy and two floral splice variants of TGS1-like. Then, we transformed sexual P. notatum with a TGS1-like antisense construction (pAct1-F1as). Phenotypic analysis revealed trichomes in leaves, and occasional formation of twin ovules. While control plants displayed a single meiotic embryo sac per ovule, antisense lines showed 12.93–15.79% of ovules bearing aposporous-like embryo sacs (AES-like), while 8.42–9.52% showed both meiotic and aposporous-like sacs. Besides, at early developmental stages, 32.5% of the ovules displayed nucellar cells resembling apospory initials (AIs) surrounding the megaspore mother cell (MMC) or the MMC-derived meiotic products. Flow cytometry analyses of caryopses in antisense lines revealed that full seeds originated only by sexuality. A reduction of 25.55% in the germination percentage was detected in antisense lines. To analyze whether TGS1-like affects the splicing, we selected 316 transcripts differentially expressed in flowers of apomitic and sexual plants, with values of FDR <6.74E-10, and examined the existence of putative splice variants. Using qPCR analysis in several apomictic and sexual individuals, we confirmed that the unprocessed splicing variant of one of these transcripts (CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1B-21, CHLORO) is less represented in apomictic plants. An analysis of the tgs1-like antisense lines confirmed that the representation of the unprocessed splicing variant is also diminished, confirming that CHLORO is one of the TGS1-like targets. In addition, we identified a group of splicing-related transcripts with differential representation in reproductive organs of P. notatum plants, and determined that they form an interaction network including TGS1-like. We concluded that PN_TGS1-like is an apospory repressor, participates in splicing and target the CHLORO transcript. Numerous splicing genes integrate an interaction network with differential expression during apomixis.Fil: Apellido, Nombre. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaColono, Carolina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas y Facultad de Ciencias Agrarias; Argentin

Spotting the Targets of the Apospory Controller TGS1 in Paspalum notatum

International audienceSexuality and apomixis are interconnected plant reproductive routes possibly behaving as polyphenic traits under the influence of the environment. In the subtropical grass Paspalum notatum, one of the controllers of apospory, a main component of gametophytic apomixis reproduction, is TRIMETHYLGUANOSINE SYNTHASE 1 (TGS1), a multifunctional gene previously associated with RNA cleavage regulation (including mRNA splicing as well as rRNA and miRNA processing), transcriptional modulation and the establishment of heterochromatin. In particular, the downregulation of TGS1 induces a sexuality decline and the emergence of aposporous-like embryo sacs. The present work was aimed at identifying TGS1 target RNAs expressed during reproductive development of Paspalum notatum. First, we mined available RNA databases originated from spikelets of sexual and apomictic plants, which naturally display a contrasting TGS1 representation, to identify differentially expressed mRNA splice variants and miRNAs. Then, the role of TGS1 in the generation of these particular molecules was investigated in antisense tgs1 sexual lines. We found that CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1B-21 (LHC Ib-21, a component of the chloroplast light harvesting complex), QUI-GON JINN (QGJ, encoding a MAP3K previously associated with apomixis) and miR2275 (a meiotic 24-nt phasi-RNAs producer) are directly or indirectly targeted by TGS1. Our results point to a coordinated control exercised by signal transduction and siRNA machineries to induce the transition from sexuality to apomixis

Spotting the Targets of the Apospory Controller TGS1 in Paspalum notatum

Sexuality and apomixis are interconnected plant reproductive routes possibly behaving as polyphenic traits under the influence of the environment. In the subtropical grass Paspalum notatum, one of the controllers of apospory, a main component of gametophytic apomixis reproduction, is TRIMETHYLGUANOSINE SYNTHASE 1 (TGS1), a multifunctional gene previously associated with RNA cleavage regulation (including mRNA splicing as well as rRNA and miRNA processing), transcriptional modulation and the establishment of heterochromatin. In particular, the downregulation of TGS1 induces a sexuality decline and the emergence of aposporous-like embryo sacs. The present work was aimed at identifying TGS1 target RNAs expressed during reproductive development of Paspalum notatum. First, we mined available RNA databases originated from spikelets of sexual and apomictic plants, which naturally display a contrasting TGS1 representation, to identify differentially expressed mRNA splice variants and miRNAs. Then, the role of TGS1 in the generation of these particular molecules was investigated in antisense tgs1 sexual lines. We found that CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1B-21 (LHC Ib-21, a component of the chloroplast light harvesting complex), QUI-GON JINN (QGJ, encoding a MAP3K previously associated with apomixis) and miR2275 (a meiotic 24-nt phasi-RNAs producer) are directly or indirectly targeted by TGS1. Our results point to a coordinated control exercised by signal transduction and siRNA machineries to induce the transition from sexuality to apomixis

Small rna-seq reveals novel regulatory components for apomixis in paspalum notatum

Background: Apomixis is considered an evolutionary deviation of the sexual reproductive pathway leading to the generation of clonal maternal progenies by seeds. Recent evidence from model and non-model species suggested that this trait could be modulated by epigenetic mechanisms involving small RNAs (sRNAs). Here we profiled floral sRNAs originated from apomictic and sexual Paspalum notatum genotypes in order to identify molecular pathways under epigenetic control that might be involved in the transition from sexuality to agamospermy. Results: The mining of genes participating in sRNA-directed pathways from floral Paspalum transcriptomic resources showed these routes are functional during reproductive development, with several members differentially expressed in apomictic and sexual plants. Triplicate floral sRNA libraries derived from apomictic and a sexual genotypes were characterized by using high-Throughput sequencing technology. EdgeR was apply to compare the number of sRNA reads between sexual and apomictic libraries that map over all Paspalum floral transcripts. A total of 1525 transcripts showed differential sRNA representation, including genes related to meiosis, plant hormone signaling, biomolecules transport, transcription control and cell cycle. Survey for miRNA precursors on transcriptome and genome references allowed the discovery of 124 entities, including 40 conserved and 8 novel ones. Fifty-six clusters were differentially represented in apomictic and sexual plants. All differentially expressed miRNAs were up-regulated in apomictic libraries but miR2275, which showed different family members with opposed representation. Examination of predicted miRNAs targets detected 374 potential candidates. Considering sRNA, miRNAs and target surveys together, 14 genes previously described as related with auxin metabolism, transport and signaling were detected, including AMINO ACID/AUXIN PERMEASE 15, IAA-AMIDO SYNTHETASE GH3-8, IAA30, miR160, miR167, miR164, miR319, ARF2, ARF8, ARF10, ARF12, AFB2, PROLIFERATING CELL FACTOR 6 and NITRATE TRANSPORTER 1.1. Conclusions: This work provides a comprehensive survey of the sRNA differential representation in flowers of sexual and apomictic Paspalum notatum plants. An integration of the small RNA profiling data presented here and previous transcriptomic information suggests that sRNA-mediated regulation of auxin pathways is pivotal in promoting apomixis. These results will underlie future functional characterization of the molecular components mediating the switch from sexuality to apomixis.Fil: Ortiz, Juan Pablo Amelio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Leblanc, Olivier. Université Montpellier II; FranciaFil: Rohr, Cristian Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Agrobiotecnología de Rosario; ArgentinaFil: Grisolía, Mauricio Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Agrobiotecnología de Rosario; ArgentinaFil: Siena, Lorena Adelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Podio, Maricel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Colono, Carolina Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Azzaro, Celeste Antonela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; ArgentinaFil: Pessino, Silvina Claudia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; Argentin

The MAP3K-Coding QUI-GON JINN (QGJ) gene is essential to the formation of unreduced embryo sacs in Paspalum.

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