Effects of augmented O-GlcNAcylation on calcium influx and calcium uptake by the sarcoplasmic reticulum in the rat aorta: functional analysis.

A O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-translacional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: a enzima OGT é responsável por catalisar a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina e treonina, enquanto a OGA catalisa a remoção de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvo de O-GlcNAc e o aumento da expressão de proteínas modificadas por O-GlcNAc promove aumento da reatividade vascular para estímulos contráteis. Um dos mecanismos de extrema importância no controle do tônus vascular está ligado à regulação da concentração de cálcio (Ca2+) intracelular, onde destacamos a participação do sistema STIM1/Orai1. As moléculas de interação estromal (STIM) atuam como sensores dos estoques intracelulares de Ca2+ e as proteínas Orai representam as subunidades que formam os canais de Ca2+ ativados pela liberação de Ca2+ (CRAC). Neste estudo investigamos a hipótese de que o aumento dos níveis vasculares de proteínas glicosiladas aumenta a resposta contrátil em aorta de ratos, por mecanismos relacionados ao controle da concentração intracelular de Ca2+.Em nossos experimentos, utilizamos aortas torácicas de ratos incubadas com PugNAc (inibidor seletivo da OGA, ), por 24h. Utilizando protocolo experimental que permite avaliar contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ e liberação de Ca2+ intracelular, demonstramos que a incubação com PugNAc aumentou a resposta contrátil à PE bem como a contração durante o período de influxo de Ca2+, induzida pela reintrodução de solução fisiológica contendo Ca2+ (1,56 mM). O bloqueio dos canais CRAC com 2-APB (100 ) e gadolíneo (Gd3+, 100 ) diminuiu significativamente as contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ em aortas incubadas com PugNAc. Além disso, estas aortas apresentaram aumento da expressão protéica de STIM1, o que resultaria em maior influxo de Ca2+. A contração induzida por cafeína (20 mM) e serotonina (10 ), a qual reflete a capacidade funcional do retículo sarcoplasmático (RS) em captar Ca2+, foi maior em aortas incubadas com PugNAc. O papel da Ca2+-ATPase (SERCA) foi avaliado com a utilização de tapsigargina, bloqueador da SERCA. O efeito da tapsigargina foi semelhante em artérias incubadas com PugNAc e veículo, apesar do aumento de expressão proteica da SERCA em aortas incubadas com PugNAc. Como a proteína cinase C (PKC) é ativada por aumentos de Ca2+ intracelular, determinamos se a atividade de proteínas alvo da PKC estavam aumentadas. A incubação com PugNAc aumentou a expressão das formas fosforiladas da CPI-17, MYPT-1 e MLC. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação de STIM1/Orai1, aumento da liberação de Ca2+ intracelular e ativação da via de sinalização da PKC podem representar mecanismos que modulam as alterações vasculares em resposta ao aumento de proteínas glicosiladas por O-GlcNAc.Glycosylation with O-linked -N-acetyl-glucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification. The process of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: the OGT enzyme catalyses the addition of N-acetyl-glucosamine to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, while OGA catalyzes the cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified proteins. Proteins with an important role in vascular function are targets of O-GlcNAc and increased levels of proteins modified by O-GlcNAc increase vascular reactivity to contractile stimuli. The regulation of intracellular calcium (Ca2+) concentration, including the activation of STIM1/Orai1, is key in the control of vascular tone. The stromal interaction molecules (STIM) act as sensors of intracellular Ca2+ stores whereas the Orai proteins represent subunits of the Ca2+ release-activated Ca2+ channels (CRAC). We hypothesized that increased levels of vascular O-GlcNAc proteins augment vascular contractile responses by altering mechanisms that regulate the intracellular Ca2+. Rat thoracic aortas were incubated with PugNAc (OGA selective inhibitor, ) for 24h. Using an experimental protocol that evaluates contractions induced by Ca2+ influx and release, we demonstrated that incubation with PugNAc increases contractile responses to phenylephrine (PE) as well as the contraction induced by Ca2+ influx, after depletion of intracellular Ca2+ stores. The CRAC channel blockers, 2-APB (100 ) and gadolinium (Gd3+, 100 ), significantly reduced the contractions induced by Ca2+ influx in aortas incubated with PugNAc. Furthermore, these aortas showed increased STIM1 protein expression, which could result in increased influx of Ca2+ and, in turn, increase vascular contraction. The contraction induced by the release of intracellular Ca2+ stores, stimulated by caffeine (20 mM) and serotonin (10 ), was increased in aortas incubated with PugNAc. The Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor thapsigargin produced similar effects in arteries incubated with PugNAc or vehicle, despite the increased SERCA protein expression in aortas incubated with PugNAc. Since PKC is activated by increases in intracellular Ca2+ and arteries incubated with PugNAc show activation of PKC, we determined whether the activity of proteins that are targets of PKC was increased in PugNAc-treated aortas. Incubation with PugNAc increased the expression of phosphorylated forms of CPI-17, MYPT-1 and MLC. Together, these results suggest that activation of STIM1/Orai1, increased release of intracellular Ca2+ and PKC activation may represent mechanisms that modulate vascular responses upon increased O-GlcNAc proteins

Effects of acute increases on O-GlcNAcylation in the release of inflammatory mediators and vascular function in mice with endotoxemia

A O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação póstraducional altamente dinâmica, controlada por duas enzimas: a OGT, responsável por catalisar a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina e treonina; e a OGA, que catalisa a remoção de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Condições crônicas de aumento de proteínas O-GlcNAc estão associadas a disfunções vasculares e a efeitos negativos no coração. No entanto, os efeitos agudos produzidos pelo aumento de O-GlcNAc estão associados a uma melhora na função cardíaca, redução dos níveis vasculares de mediadores pró-inflamatórios. Neste estudo testamos a hipótese que o aumento agudo da modificação por O-GlcNAc reduz os níveis sistêmicos de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1?, IL-6 e TNF-?, bem como a ativação do fator de transcrição NF-?B, reduzindo o processo inflamatório e disfunção vascular em animais com endotoxemia. Foram utilizados camundongos C57BL6/J que receberam lipopolissacarídeo (LPS) para o desenvolvimento de endotoxemia severa (LPS sev, 20 mg/Kg, i.p.) ou veículo (controle). Os animais também receberam glucosamina (GlcN; 300 mg/Kg; i.v.; 30 min antes do LPS), ThG (150 ?g/Kg, i.v.; 12 h antes do LPS) ou veículo e foram sacrificados 6 horas após a indução da endotoxemia com LPS. Os tratamentos prévios com GlcN e ThG aumentaram a sobrevida dos animais (50 % e 60 % na endotoxemia sev). A determinação dos níveis sistêmicos de IL-1?, IL-6 e TNF-? e da expressão gênica vascular destas citocinas [mRNA (2-??CT) em aorta e leito mesentérico] demonstrou que os tratamentos prévios com GlcN e ThG reduziram a expressão de IL- 1?, IL-6 e TNF-? em animais com endotoxemia. O tratamento prévio com GlcN atenuou, mas não normalizou a hipotensão arterial causada pela endotoxemia por LPS. Não foram observadas alterações de reatividade na artéria aorta de animais que receberam LPS, ou LPS + GlcN. Entretanto, os tratamentos prévios com GlcN e ThG atenuaram a refratariedade a vasoconstrictores observada em artéria mesentérica de resistência de animais que receberam somente LPS. O aumento dos níveis de proteínas glicosiladas, com GlcN e ThG, em cultura de macrófagos provenientes da medula óssea de camundongos C57BL6/J corroboram os resultados descritos acima. Os níveis de citocinas no sobrenadante da cultura de macrófagos, bem como a expressão gênica destas citocinas, e a produção de nitrito por estas células foram menores em células submetidas ao tratamento com GlcN e ThG. Além da endotoxemia por LPS, avaliamos os efeitos do tratamento com GlcN em um modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP) e os resultados corroboram os dados obtidos nos animais com endotoxemia e na cultura de macrófagos. Portanto, o aumento agudo da modificação por O-GlcNAc em animais com endotoxemia por LPS promove aumento da sobrevida dos animais, redução nos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1?, IL-6 e TNF-? e redução da disfunção vascular e hipotensão arterial. Conclusão: Aumento agudo de O-GlcNAc reduz o processo inflamatório e atenua eventos cardiovasculares associados a endotoxemia por LPS, sugerindo que essa via representa um possível alvo em condições de resposta inflamatória sistêmica.The post-translational modification of proteins by O-GlcNAcylation (O-GlcNAc) is highly dynamic and modulates cell-signaling processes. Chronic conditions that increase the levels of O-GlcNAc-modified proteins are associated with vascular disorders. However, acute increases in O-GlcNAc levels reduce the release of proinflammatory mediators and negatively regulate inflammatory processes by decreasing e.g. NF-?B activation. This study tested the hypothesis that acute increases of O-GlcNAc levels reduce mortality and inflammatory processes in experimental models of sepsis. Male C57BL6/J mice received lipopolysaccharide (LPS) for the development of severe (LPS sev, 20 mg / kg, i.p.) endotoxemia or vehicle (control). Mice also received glucosamine (GlcN; 300 mg / kg, iv; 30 min) or ThG (150 ?g / kg, iv; 12 h) or vehicle before LPS administration. Mice were killed 6 hours after LPS. The acute increase of OGlcNAc modification in animals with LPS-induced endotoxemia increased survival, reduced levels of proinflammatory cytokines such as IL-1?, IL-6 and TNF-? and attenuated vascular dysfunction and arterial hypotension. Treatments with GlcN and ThG reduced IL-1?, IL-6 and TNF-? [plasma levels and vascular gene expression [mRNA] (2- ??CT) in the aorta and mesenteric bed] in animals with endotoxemia. GlcN and ThG also attenuated the decreased vasoconstrictor responses and hypotension induced by LPS. Increased levels of glycosylated proteins decreased levels (in the supernatant) and expression of cytokines in cultured bone marrow-derived macrophages from C57BL6/J mice. GlcN treatment produced similar effects in an experimental model that closely resembles human sepsis, the cecum ligation and perforation (CLP) model. Conclusion: Acute increase of O-GlcNAc reduces the inflammatory process and attenuates cardiovascular events associated with LPS endotoxemia, suggesting that this pathway represents a possible target under conditions of systemic inflammatory response

Cross-Linking Mast Cell Specific Gangliosides Stimulates the Release of Newly Formed Lipid Mediators and Newly Synthesized Cytokines

Mast cells are immunoregulatory cells that participate in inflammatory processes. Cross-linking mast cell specific GD1b derived gangliosides by mAbAA4 results in partial activation of mast cells without the release of preformed mediators. The present study examines the release of newly formed and newly synthesized mediators following ganglioside cross-linking. Cross-linking the gangliosides with mAbAA4 released the newly formed lipid mediators, prostaglandins D2 and E2, without release of leukotrienes B4 and C4. The effect of cross-linking these gangliosides on the activation of enzymes in the arachidonate cascade was then investigated. Ganglioside cross-linking resulted in phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 and increased expression of cyclooxygenase-2. Translocation of 5-lipoxygenase from the cytosol to the nucleus was not induced by ganglioside cross-linking. Cross-linking of GD1b derived gangliosides also resulted in the release of the newly synthesized mediators, interleukin-4, interleukin-6, and TNF-α. The effect of cross-linking the gangliosides on the MAP kinase pathway was then investigated. Cross-linking the gangliosides induced the phosphorylation of ERK1/2, JNK1/2, and p38 as well as activating both NFκB and NFAT in a Syk-dependent manner. Therefore, cross-linking the mast cell specific GD1b derived gangliosides results in the activation of signaling pathways that culminate with the release of newly formed and newly synthesized mediators

Testosterone induces apoptosis in vascular smooth muscle cells via extrinsic apoptotic pathway with mitochondria-generated reactive oxygen species involvement

Testosterone exerts both beneficial and harmful effects on the cardiovascular system. Considering that testosterone induces reactive oxygen species (ROS) generation and ROS activate cell death signaling pathways, we tested the hypothesis that testosterone induces apoptosis in vascular smooth muscle cells (VSMCs) via mitochondria-dependent ROS generation. Potential mechanisms were addressed. Cultured VSMCs were stimulated with testosterone (10−7 mol/l) or vehicle (2–12 h) in the presence of flutamide (10−5 mol/l), CCCP (10−6 mol/l), mimetic manganese(III) tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porphyrin (MnTMPyP; 3 × 10−5 mol/l), Z-Ile-Glu(O-ME)-Thr-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone (Z-IETD-FMK; 10−5 mol/l), or vehicle. ROS were determined with lucigenin and dichlorodihydrofluorescein; apoptosis, with annexin V and calcein; O2 consumption, with a Clark-type electrode, and procaspases, caspases, cytochrome c, Bax, and Bcl-2 levels by immunoblotting. Testosterone induced ROS generation (relative light units/mg protein, 2 h; 162.6 ± 16 vs. 100) and procaspase-3 activation [arbitrary units, (AU), 6 h; 166.2 ± 19 vs. 100]. CCCP, MnTMPyP, and flutamide abolished these effects. Testosterone increased annexin-V fluorescence (AU, 197.6 ± 21.5 vs. 100) and decreased calcein fluorescence (AU, 34.4 ± 6.4 vs. 100), and O2 consumption (nmol O2/min, 18.6 ± 2.0 vs. 34.4 ± 3.9). Testosterone also reduced Bax-to-Bcl-2 ratio but not cytochrome-c release from mitochondria. Moreover, testosterone (6 h) induced cleavage of procaspase 8 (AU, 161.1 ± 13.5 vs. 100) and increased gene expression of Fas ligand (2ΔΔCt, 3.6 ± 1.2 vs. 0.7 ± 0.5), and TNF-α (1.7 ± 0.4 vs. 0.3 ± 0.1). CCCP, MnTMPyP, and flutamide abolished these effects. These data indicate that testosterone induces apoptosis in VSMCs via the extrinsic apoptotic pathway with the involvement of androgen receptor activation and mitochondria-generated ROS