On the Road to Bioremediation of “Dioxin”

Mohammadi and Sylvestre [1] report engineering of a dioxygenase to create an enzyme that attacks dibenzofuran in the lateral position. Subsequent oxidation and a second dioxygenation produced ring-open products. All metabolites were unambiguously identified by 1H-NMR. This new pathway targets degradation of chlorinated dibenzofurans

Zum Mechanismus der 2-Hydroxyglutaryl-CoA Dehydratase aus Clostridium symbiosum

Das 2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-System ist das Schlüsselenzym in der Fermentation von Glutamat zu Acetat, Butyrat, CO2 und H2 durch Clostridium symbiosum und Acidaminococcus fermentans. Die Dehydratase katalysiert die syn-Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA zu (E)-Glutaconyl-CoA. Diese Dehydratisierung ist seit Jahren von großem mechanistischem Interesse, da ein nicht azides Proton (pKs = 40) am C-3 des (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA abstrahiert werden muss. In der vorliegenden Arbeit wurden biochemische und spektroskopische Untersuchungen dieses Enzymsystems bzw. Katalysemechanismuses durchgeführt, um weitere Einblicke in Reaktion und Elektronenfluss zu erhalten. Die Reinigungsmethoden für Komponente D aus Clostridium symbiosum wurden weiter verbessert und erneute Charakterisierungen der Kofaktoren durchgeführt. Trotz Hinweise auf eine Beteiligung eines d1-Metalls am Katalysemachanismus konnten nur Spuren (10 %) von Molybdän in Komponente D als auch ein nicht weiter identifizierter „Molybdänkofaktor“ nachgewiesen werden. Durch die Einführung einer neuen Aktivitätsbestimmung der Komponente D konnte durch nicht-äquimolare Mischungen aus Komponente A und Komponente D der Beweis erbracht werden, dass nur substöchiometrische Mengen an Komponente A zur maximalen Aktivität gebraucht werden. Somit konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem postulierten Mechanismus tatsächlich um einen katalytischen Mechanismus handelt. Durch die Bildung eines AlF4--induzierten Komplexes der Komponenten A und D in Anwesenheit von ATP konnte die Interaktion und den durch ATP-Hydrolyse getriebenen Elektronentransfer von Komponente A nach Komponente D gezeigt werden. Die bisher in der Komponente D gefundenen Kofaktoren ([4Fe-4S]2+Cluster und FMNH2) zeigen keine Änderungen ihrer Redoxzustände in Anwesenheit von Komponente A und ATP. Durch die erfolgreiche Kristallisation sowohl von Komponente D als auch von AlF4--induziertem Komplex der Komponenten A und D könnten nähere Informationen über Lage und Koordination der Kofaktoren zum aktiven Zentrum geben. Durch die Lösung der 3D-Struktur der b-Untereinheit der Komponente D konnte ein ungewöhnlicher [4Fe-4S]Cluster erkannt werden, der durch 3 Cysteine (Cys 74, 101 und 332) und 1 Tyrosin (Tyr 37) koordiniert ist. An dieser Koordination sind die drei strikt konservierten Cys-Reste der hgdB-Sequenz beteiligt. Der Tyr-Rest ist hingegen nicht konserviert und wird als „Parkplatz“ des – am postulierten Katalysemechanismus beteiligten – Ketylradikals diskutiert

The stereochemistry of the formation of the methyl group in the glutamate mutase-catalysed reaction in Clostridium tetanomorphum

AbstractThe adenosylcobalamin-dependent enzyme glutamate mutase from Clostridium tetanomorphum catalyses the reversible rearrangement of (2S)-glutamate to (2S,3S)-3-methylaspartate. In this conversion 6 carbon centers are involved. The stereochemistry of 4 has been elucidated whereas the formation of the methyl group from the methylene group remains to be established. To solve this problem, (2S,3R)- and (2S,3S)-[3,3-2H1,3H]glutamates were prepared via the 2-oxo[3,3-2H2 or 3H]glutarates by incubation with isocitrate dehydrogenase in deuterium oxide or tritiated water. The labelled glutamates were fermented with growing cells of C. tetanomorphum to butyrate and acetate. Butyrate was further degraded to acetate in which methyl group over 90% of the tritium of the starting glutamate was retained. The chirality of the acetates was determined with malate synthase and fumarase. In both samples complete racemisation was found. This result confirms the rule that racemisation occurs in all adenosylcobalamin-dependent rearrangements in which methyl groups are formed. A methylene radical as intermediate could explain these observations. In a control experiment inversion of configuration in the formation of the methine group of (2S,3S)-3-methylaspartate from the methylene group of (2S)-glutamate was confirmed. Glutamates stereospecifically labelled at C-4 were synthesized from chiral acetates via citrate

Die Rolle des Signalpeptids für die Reifung des Lassavirus Glykoproteins

Das Oberflächenglykoprotein des Lassavirus ist ein Typ 1-Membranprotein. Es wird als Vorläufer präGP-C synthetisiert und posttranslational mit N-Glykanen modifiziert. Nach der proteolytischen Abspaltung des Signalpeptids wird GP-C in seine beiden Untereinheiten GP1 und GP2 durch die Wirtszellprotease SKI-1/S1P prozessiert. Das Glykoproteins weist nach Analyse mit einem Computerprogramm ein SP von außergewöhnlicher Länge auf. Thema dieser Arbeit war die Charakterisierung dieses SP. 1. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die exakte Länge des Signalpeptids von 58 Aminosäureresten durch N-terminale Sequenzierung der GP1-Untereinheit und Mutationsanalysen der potentiellen Signalpeptidspaltstelle ermittelt. 2. Topologische Untersuchungen ergaben, dass das Signalpeptid des Lassavirus Glykoproteins eine außergewöhnliche Struktur mit zwei hydrophoben Regionen besitzt. Daraus ergeben sich mehrere Möglichkeiten für die Topologie des Signalpeptids in der ER-Membran. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nur die N-terminale der beiden hydrophoben Domänen die ER-Membran durchspannt und damit ein außergewöhnlich langer Abschnitt, der auch die zweite hydrophobe Region umschließt, im ER-Lumen vorliegt. 3. Das Signalpeptid wurde auf zusätzliche Funktionen neben der Translokationsfunktion untersucht. Hierfür wurde das native Signalpeptid durch andere Signalpeptide ausgetauscht. Dieser Austausch verhindert die Reifespaltung des Glykoproteins GP-C in seine beiden Untereinheiten GP1 und GP2. Die Spaltung wird durch Koexpression des solitären ursprünglichen Signalpeptids wiederhergestellt. Mithilfe von Mutationsanalysen wurde der Bereich des Signalpeptids, der für die proteolytische Aktivierung des Glykoproteins essentiell ist, auf den ER-luminalen Anteil des Signalpeptids eingeschränkt. Weiterhin wurde gezeigt, dass besonders der Bereich zwischen beiden hydrophoben Regionen für die Reifung des Glykoproteins notwendig ist. Über Kopräzipitationsstudien wurde eine direkte Interaktion zwischen Signalpeptid und Glykoprotein bestätigt. Diese wird über eine Wechselwirkung des Signalpeptids mit der GP2-Untereinheit des Glykoproteins vermittelt. 4. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Signalpeptid ein fester Bestandteil des Virions ist. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Inkorporation des Signalpeptids von der Inkorporation des Glykoproteins abhängig ist und das Signalpeptid selbst keine 5. Die Signalpeptide der Glykoproteine der Arenaviren sind homolog, eine Austauschbarkeit der Signalpeptide zwischen den Glykoproteinen der Arenaviren wurde in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Die vorgestellten Daten sind daher auf die Signalpeptide der Glykoproteine aller Arenaviren übertragbar

On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile

Die Gene ldhA und hadA aus Clostridium difficile (DSMZ 1296T) wurden kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden gereinigt und als D-2-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (LdhA) und 2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase (HadA) identifiziert. Die Enzyme katalysieren zwei Schritte in der Fermentation von Leucin zu Ammonium, CO2, Isovalerat und Isocaproat. Die nächsten im Genom von C. difficile liegenden Gene hadBC und hadI wurden ebenfalls aktiv exprimiert und als 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (HadBC) und ihrem Aktivator (HadI) identifiziert. Die Dehydratase katalysiert die Eliminierung von Wasser aus (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA zu Isocaprenoyl-CoA, die eine chemisch schwierige Reaktion darstellt, da das Proton in der b-Position nicht aktiviert ist (pK ca. 40). Wir postulieren, dass erst die Reduktion des Substrats mit einem Elektron die Eliminierung ermöglicht, wobei der pK mindestens bis 14 gesenkt wird. Anschließend wird das Elektron wieder ans Enzym zurückgegeben. Die heterodimere Dehydratase und der homodimere Aktivator sind Eisen-Schwefel-Proteine, in denen keine weiteren prosthetischen Gruppen (oder Metalle wie Molybdän) detektiert werden konnten. Der durch Ferredoxin reduzierte Aktivator überträgt unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase, die dadurch in den katalytisch aktiven Zustand überführt wird. Dieser ATP-getriebene Elektronen-Transfer ähnelt dem der Nitrogenase. Die aktivierte und vom Aktivator abgetrennte Dehydratase katalysiert ca. 10000 Umsätze bis das Elektron durch Oxidation verloren geht. Durch anschließende Zugabe von ATP und Aktivator kann die inaktivierte Dehydratase wieder voll aktiviert werden. Die Bildung eines stabilen aktiven AlF4--induzierten Komplexes aus Dehydratase und Aktivator stützt den postulierten Elektronentransport vom Aktivator zur Dehydratase und zeigt ebenfalls die Rückgewinnung des benötigten Elektrons nach jedem Turnover. In Übereinstimmung damit werden zur maximalen Aktivität nur substöchiometrische Mengen an Aktivator (Aktivator/Dehydratase = 1:10) benötigt. Mit Hilfe der EPR-Spektroskopie wurde zum ersten Mal während der Dehydratisierung eines 2-Hydroxyacyl-CoA-Derivats ein organisches Radikalsignal detektiert. Mit Hilfe von isotopmarkierten Substraten veränderten sich die EPR-Spektren in einer für das Ketylradikalanion des Isocaprenoyl-CoA charakteristischen Weise

Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans: the crystal structure reveals homology with other CoA-transferases

AbstractBackground: Coenzyme A-transferases are a family of enzymes with a diverse substrate specificity and subunit composition. Members of this group of enzymes are found in anaerobic fermenting bacteria, aerobic bacteria and in the mitochondria of humans and other mammals, but so far none have been crystallized. A defect in the human gene encoding succinyl-CoA: 3-oxoacid CoA-transferase causes a metabolic disease which leads to severe ketoacidosis, thus reflecting the importance of this family of enzymes. All CoA-transferases share a common mechanism in which the CoA moiety is transferred from a donor (e.g. acetyl CoA) to an acceptor, (R)-2-hydroxyglutarate, whereby acetate is formed. The transfer has been described by a ping-pong mechanism in which CoA is bound to the active-site residue of the enzyme as a covalent thiol ester intermediate. We describe here the crystal structure of glutaconate CoA-transferase (GCT) from the strictly anaerobic bacterium Acidaminococcus fermentans. This enzyme activates (R)-2-hydroxyglutarate to (R)-2-hydroxyglutaryl-CoA in the pathway of glutamate fermentation. We initiated this project to gain further insight into the function of this enzyme and the structural basis for the characteristics of CoA-transferases.Results: The crystal structure of GCT was solved by multiple isomorphous replacement to 2.55 Å resolution. The enzyme is a heterooctamer and its overall arrangement of subunits can be regarded as an (AB)4tetramer obeying 222 symmetry. Both subunits A and B belong to the open α/β-protein class and can be described as a four-layered α/α/β/α type with a novel composition and connectivity of the secondary structure elements. The core of subunit A consists of seven α/β repeats resulting in an all parallel central β sheet, against which helices pack from both sides. In contrast, the centre of subunit B is formed by a ninefold mixed β sheet. Inboth subunits the helical C terminus is folded back onto the N-terminal domain to form the third layer of helices.Conclusions: The active site of GCT is located at the interface of subunits A and B and is formed by loops of both subunits. The funnel-shaped opening to the active site has a depth and diameter of about 20 Å with the catalytic residue, Glu54 of subunit B, at the bottom. The active-site glutamate residue is stabilized by hydrogen bonds. Despite very low amino acid sequence similarity, subunits A and B reveal a similar overall fold. Large parts of their structures can be spatially superimposed, suggesting that both subunits have evolved from a common ancestor

Spectroscopic evidence for an all-ferrous [4Fe–4S]0 cluster in the superreduced activator of 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase from Acidaminococcus fermentans

The key enzyme of the fermentation of glutamate by Acidaminococcus fermentans, 2-hydroxyglutarylcoenzyme A dehydratase, catalyzes the reversible syn-elimination of water from (R)-2-hydroxyglutaryl-coenzyme A, resulting in (E)-glutaconylcoenzyme A. The dehydratase system consists of two oxygen-sensitive protein components, the activator (HgdC) and the actual dehydratase (HgdAB). Previous biochemical and spectroscopic studies revealed that the reduced [4Fe–4S]+ cluster containing activator transfers one electron to the dehydratase driven by ATP hydrolysis, which activates the enzyme. With a tenfold excess of titanium(III) citrate at pH 8.0 the activator can be further reduced, yielding about 50% of a superreduced [4Fe–4S]0 cluster in the all-ferrous state. This is inferred from the appearance of a new Mössbauer spectrum with parameters δ = 0.65 mm/s and ΔEQ = 1.51–2.19 mm/s at 140 K, which are typical of Fe(II)S4 sites. Parallel-mode electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy performed at temperatures between 3 and 20 K showed two sharp signals at g = 16 and 12, indicating an integer-spin system. The X-band EPR spectra and magnetic Mössbauer spectra could be consistently simulated by adopting a total spin St = 4 for the all-ferrous cluster with weak zero-field splitting parameters D = −0.66 cm−1 and E/D = 0.17. The superreduced cluster has apparent spectroscopic similarities with the corresponding [4Fe–4S]0 cluster described for the nitrogenase Fe-protein, but in detail their properties differ. While the all-ferrous Fe-protein is capable of transferring electrons to the MoFe-protein for dinitrogen reduction, a similar physiological role is elusive for the superreduced activator. This finding supports our model that only one-electron transfer steps are involved in dehydratase catalysis. Nevertheless we discuss a common basic mechanism of the two diverse systems, which are so far the only described examples of the all-ferrous [4Fe–4S]0 cluster found in biology

Anaerobic Microbial Degradation of Hydrocarbons: From Enzymatic Reactions to the Environment

Hydrocarbons are abundant in anoxic environments and pose biochemical challenges to their anaerobic degradation by microorganisms. Within the framework of the Priority Program 1319, investigations funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft on the anaerobic microbial degradation of hydrocarbons ranged from isolation and enrichment of hitherto unknown hydrocarbon-degrading anaerobic microorganisms, discovery of novel reactions, detailed studies of enzyme mechanisms and structures to process-oriented in situ studies. Selected highlights from this program are collected in this synopsis, with more detailed information provided by theme-focused reviews of the special topic issue on 'Anaerobic biodegradation of hydrocarbons' [this issue, pp. 1-244]. The interdisciplinary character of the program, involving microbiologists, biochemists, organic chemists and environmental scientists, is best exemplified by the studies on alkyl-/arylalkylsuccinate synthases. Here, research topics ranged from in-depth mechanistic studies of archetypical toluene-activating benzylsuccinate synthase, substrate-specific phylogenetic clustering of alkyl-/arylalkylsuccinate synthases (toluene plus xylenes, p-cymene, p-cresol, 2-methylnaphthalene, n-alkanes), stereochemical and co-metabolic insights into n-alkane-activating (methylalkyl) succinate synthases to the discovery of bacterial groups previously unknown to possess alkyl-/arylalkylsuccinate synthases by means of functional gene markers and in situ field studies enabled by state-of-the-art stable isotope probing and fractionation approaches. Other topics are Mo-cofactor-dependent dehydrogenases performing O-2-independent hydroxylation of hydrocarbons and alkyl side chains (ethylbenzene, p-cymene, cholesterol, n-hexadecane), degradation of p-alkylated benzoates and toluenes, glycyl radical-bearing 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase, novel types of carboxylation reactions (for acetophenone, acetone, and potentially also benzene and naphthalene), W-cofactor-containing enzymes for reductive dearomatization of benzoyl-CoA (class II benzoyl-CoA reductase) in obligate anaerobes and addition of water to acetylene, fermentative formation of cyclohexanecarboxylate from benzoate, and methanogenic degradation of hydrocarbons