Étude du système de régulation du gène de la chitosanase chez Nocardioides SP.N106

L'intérêt que suscitent les actinomycètes en recherche provient de leur capacité à produire de nombreux antibiotiques, à produire des enzymes d'intérêt industriel et à être des bons candidats pour la production de protéines homologues et hétérologues. Les activités de recherche ont permis de développer des techniques de laboratoire et des outils biomoléculaires qui permettent la mise en valeur des actinomycètes. L'optimisation de vecteurs pour l'expression de protéines constitue un domaine de recherche très actif. Parmi les vecteurs développés, peu permettent l'induction à un moment précis de l'expression de la protéine. L'établissement d'un système d'induction requiert quelques éléments de base comme un régulateur de transcription, un site d'attachement du régulateur à l'ADN et un inducteur qui provoque soit le détachement (répresseur) soit l'attachement (activateur) du régulateur permettant ainsi la transcription du gène. Ces éléments sont obtenus à partir de systèmes naturels qui ont fait l'objet de différentes études. Les travaux rapportés dans ce mémoire présentent une étude du système d'expression du gène de la chitosanase de Nocardioides sp. N106. Cette étude va permettre la compréhension du système de régulation afin de l'utiliser pour la construction d'un système d'expression inductible par le chitosane."--Résumé abrégé par UMI

L’évaluation de la performance des collèges publics québécois par la méthode du Data Envelopment Analysis

Le système collégial public québécois est très dépendant financièrement des subventions accordées par le gouvernement provincial. En effet, 85 % des revenus des collèges d’enseignement général et professionnel (cégeps) proviennent de subventions gouvernementales. Les cégeps se plaignent d’un sous-financement chronique depuis les fortes coupures budgétaires qu’a connu le système d’enseignement québécois pendant les années quatre-vingt-dix. Avant d’appuyer ce discours, il faut vérifier si les cégeps prouvent leur efficience dans la gestion des fonds publics. C’est cette mesure d’efficience des cégeps que nous faisons dans cette étude.Nous évaluons l’efficience des cégeps à l’aide de la méthode du Data Envelopment Analysis (DEA) à partir d’une banque de données originale fournie par le ministère de l’Éducation, du Loisir et du Sport du Québec. Nous calculons ainsi une efficience relative, en comparant les cégeps les uns aux autres. Notre étude établit que les cégeps sont, en moyenne, efficients à 90 %. Ceci représente des économies potentielles d’environ 140 millions de dollars, soit 10 % des dépenses totales des cégeps. Nous montrons également que l’efficience des cégeps a varié dans le temps et est inversement liée aux subventions budgétaires, l’efficience ayant augmenté lors des coupures budgétaires.In the Province of Québec, public colleges depend heavily on public funding: 85% of their budget come from the Department of Education. Those institutions complain that their financial resources are insufficient since Québec government decided to cut their budget in the mid-90. Of course, this suppose that they are efficient, that is, there is no waste in their use of inputs (labour, energy, equipment, etc.). In this paper, our goal is to measure this (in)efficiency.We evaluate the efficiency of the colleges using Data Envelopment Analysis (DEA) based on micro-data. Our paper shows that the average level of inefficiency is around 10%. This represents a potential for budget reductions of 140 millions dollars per year. We also show that the level of inefficiency is not constant over time and that it is inversely related to public investment. The efficiency increased in periods of budget cuts

Scalable lentiviral vector production using stable producer cell lines in perfusion mode

Lentiviral vectors (LVs) are becoming an important tool in gene and cell therapy and are being utilized in several clinical studies against genetic and acquired diseases, as well as in cancer therapies. To address the challenges linked to the generation of preclinical and clinical supply, the National Research Council Canada has developed packaging cell lines and stable producer cell lines for the production of LVs which can grow in suspension in serum-free media and produce LV in the 106 TU/ml range without optimization. We focus on the development of perfusion processes to both intensify the process and harvest produced LV rapidly

The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells

BACKGROUND: A number of expression systems have been developed where transgene expression can be regulated. They all have specific characteristics making them more suitable for certain applications than for others. Since some applications require the regulation of several genes, there is a need for a variety of independent yet compatible systems. RESULTS: We have used the regulatory mechanisms of bacterial operons (cmt and cym) to regulate gene expression in mammalian cells using three different strategies. In the repressor configuration, regulation is mediated by the binding of the repressor (CymR) to the operator site (CuO), placed downstream of a strong constitutive promoter. Addition of cumate, a small molecule, relieves the repression. In the transactivator configuration, a chimaeric transactivator (cTA) protein, formed by the fusion of CymR with the activation domain of VP16, is able to activate transcription when bound to multiple copies of CuO, placed upstream of the CMV minimal promoter. Cumate addition abrogates DNA binding and therefore transactivation by cTA. Finally, an adenoviral library of cTA mutants was screened to identify a reverse cumate activator (rcTA), which activates transcription in the presence rather than the absence of cumate. CONCLUSION: We report the generation of a new versatile inducible expression system

Lentivector Producer Cell Lines with Stably Expressed Vesiculovirus Envelopes

Retroviral and lentiviral vectors often use the envelope G protein from the vesicular stomatitis virus Indiana strain (VSVind.G). However, lentivector producer cell lines that stably express VSVind.G have not been reported, presumably because of its cytotoxicity, preventing simple scale-up of vector production. Interestingly, we showed that VSVind.G and other vesiculovirus G from the VSV New Jersey strain (VSVnj), Cocal virus (COCV), and Piry virus (PIRYV) could be constitutively expressed and supported lentivector production for up to 10 weeks. All G-enveloped particles were robust, allowing concentration and freeze-thawing. COCV.G and PIRYV.G were resistant to complement inactivation, and, using chimeras between VSVind.G and COCV.G, the determinant for complement inactivation of VSVind.G was mapped to amino acid residues 136–370. Clonal packaging cell lines using COCV.G could be generated; however, during attempts to establish LV producer cells, vector superinfection was observed following the introduction of a lentivector genome. This could be prevented by culturing the cells with the antiviral drug nevirapine. As an alternative countermeasure, we demonstrated that functional lentivectors could be reconstituted by admixing supernatant from stable cells producing unenveloped virus with supernatant containing envelopes harvested from cells stably expressing VSVind.G, COCV.G, or PIRYV.G.NIBSC; EPSRC; UCL Cancer Institute Research Trust

Étude du système de régulation du gène de la chitosanase chez Nocardioides SP.N106

L'intérêt que suscitent les actinomycètes en recherche provient de leur capacité à produire de nombreux antibiotiques, à produire des enzymes d'intérêt industriel et à être des bons candidats pour la production de protéines homologues et hétérologues. Les activités de recherche ont permis de développer des techniques de laboratoire et des outils biomoléculaires qui permettent la mise en valeur des actinomycètes. L'optimisation de vecteurs pour l'expression de protéines constitue un domaine de recherche très actif. Parmi les vecteurs développés, peu permettent l'induction à un moment précis de l'expression de la protéine. L'établissement d'un système d'induction requiert quelques éléments de base comme un régulateur de transcription, un site d'attachement du régulateur à l'ADN et un inducteur qui provoque soit le détachement (répresseur) soit l'attachement (activateur) du régulateur permettant ainsi la transcription du gène. Ces éléments sont obtenus à partir de systèmes naturels qui ont fait l'objet de différentes études. Les travaux rapportés dans ce mémoire présentent une étude du système d'expression du gène de la chitosanase de Nocardioides sp. N106. Cette étude va permettre la compréhension du système de régulation afin de l'utiliser pour la construction d'un système d'expression inductible par le chitosane."--Résumé abrégé par UMI

Protein production using lentiviral vectors

NRC publication: Ye

Development of stable packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors under GMP

Peer reviewed: YesNRC publication: Ye

High-level recombinant protein production in CHO cells using lentiviral vectors and the cumate gene-switch

Fast and efficient production of recombinant proteins for structural and functional studies is a crucial issue for research and for industry. To this end, we have developed an efficient system to generate in less than 2 months, starting from the cDNA, pools of CHO cells stably expressing high-level of recombinant proteins. It is based on lentiviral vectors (LVs) for stable transduction coupled with the cumate gene-switch for inducible and efficient gene expression. Transcription is initiated upon binding of the cumate transactivator (cTA) or the reverse cTA (rcTA) to the CR5 promoter. Binding of cTA or rcTA is prevented or induced by addition of cumate respectively. We first validated the CHO/LV production system with an LV carrying the secreted alkaline phosphatase (SEAP), whose expression was linked to the green fluorescent protein (GFP) through an internal ribosome entry site (IRES). CHO cells stably expressing the cTA (CHO-cTA) were transduced at various multiplicity of infection (MOI). Pools of cells were incubated at 37 and 30-\ua6C during 10 days. Optimal SEAP production (65++g/mL) was achieved at 30-\ua6C with a MOI of 200. The pool stability was demonstrated for 48 days of culture by GFP expression analysis. The system was also evaluated using LV expressing three typical therapeutic proteins (a protein made up of the extracellular domain of CD200 fused to IgG Fc region [CD200Fc], a chimeric antibody [chB43], and erythropoietin [EPO]). CHO cells expressing rcTA (CHO-Cum2) were transduced with these LVs at a MOI of 200 and production was tested at 30-\ua6C. After 13 days of culture, 235, 160, and 206mg/mL of CD200Fc, chB43, and EPO were produced, respectively. The ON/OFF ratio of these pools was equal to 6 for CD200Fc, 16 for chB43, and 74 for EPO. In conclusion, this system should be very useful to produce mg quantities of recombinant proteins in a timely manner in serum free suspension culture of CHO cells for preclinical studies.La production rapide et efficace de prot\ue9ines recombinantes pour effectuer des \ue9tudes structurales et fonctionnelles constitue un aspect crucial dans les milieux de la recherche et de l\u2019industrie. \uc0 cette fin, nous avons mis au point un syst\ue8me efficace qui permet de produire en moins de deux mois, \ue0 partir d\u2019ADNc, des pools de cellules CHO qui expriment de fa\ue7on stable des quantit\ue9s importantes de prot\ue9ines recombinantes. Ce syst\ue8me repose sur des vecteurs lentiviraux (LV), pour assurer une stabilit\ue9 de la transduction, combin\ue9s avec le commutateur g\ue9n\ue9tique r\ue9gul\ue9 par le cumate pour assurer une expression g\ue9n\ue9tique inductible et efficace. La transcription d\ue9bute par la liaison du transactivateur au cumate (cTA) ou du cTA invers\ue9 (rcTA) au promoteur CR5. L\u2019ajout du cumate permet d\u2019emp\ueacher ou d\u2019induire la liaison du cTA ou du rcTA respectivement. Nous avons d\u2019abord valid\ue9 le syst\ue8me de production CHO/LV au moyen d\u2019un LV transportant la phosphatase alcaline s\ue9cr\ue9t\ue9e ou SEAP [secreted alkaline phosphatase], dont l\u2019expression est li\ue9e \ue0 la prot\ue9ine de fluorescence verte ou GFP [green fluorescent protein] gr\ue2ce \ue0 une s\ue9quence IRES [internal ribosome entry site]. Nous avons transduit les cellules CHO exprimant de fa\ue7on stable le cTA (CHO cTA) \ue0 des multiplicit\ue9s d\u2019infection ou MOI [multiplicity of infection] diff\ue9rentes. Des pools de cellules ont \ue9t\ue9 incub\ue9s \ue0 37 et \ue0 30 oC pendant dix jours. La production optimale de SEAP (65 \u3bcg/ml) a \ue9t\ue9 obtenue \ue0 30 oC et \ue0 une MOI de 200. L\u2019analyse de l\u2019expression de la GFP a permis de d\ue9montrer la stabilit\ue9 du pool apr\ue8s 48 jours de culture. Nous avons \ue9galement \ue9valu\ue9 le syst\ue8me au moyen d\u2019un LV exprimant trois prot\ue9ines th\ue9rapeutiques types (une prot\ue9ine compos\ue9e du domaine extracellulaire de CD200 fusionn\ue9 \ue0 la r\ue9gion Fc de l\u2019IgG [CD200Fc], un anticorps chim\ue8re [chB43] et l\u2019\ue9rythropo\uef\ue9tine [EPO]). Les cellules CHO exprimant le rcTA (CHO Cum2) ont \ue9t\ue9 transduites par ces LV \ue0 une MOI de 200, et la production a \ue9t\ue9 effectu\ue9e \ue0 30 oC. Apr\ue8s 13 jours de culture, nous avons obtenu une production de 235 mg/ml de CD200Fc, de 160 mg/ml de chB43 et de 206 mg/ml d\u2019EPO. Le rapport ON/OFF [ON/OFF ratio] de ces pools \ue9tait de 6 pour la CD200Fc, de 16 pour le chB43 et de 74 pour l\u2019EPO. En conclusion, ce syst\ue8me devrait \ueatre tr\ue8s utile pour produire des quantit\ue9s de l\u2019ordre du milligramme de prot\ue9ines recombinantes en temps voulu dans une culture de cellules CHO en suspension dans un milieu sans s\ue9rum en vue d\u2019\ue9tudes pr\ue9cliniques.Peer reviewed: YesNRC publication: Ye