Synthesis of globopentaose using a novel β1,3-galactosyltransferase activity of the Haemophilus influenzae β1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase LgtD

AbstractWe have previously described a bacterial system for the conversion of globotriaose (Gb3) into globotetraose (Gb4) by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing the Haemophilus influenzae lgtD gene encoding β1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase [Antoine, T., Bosso, C., Heyraud, A. Samain, E. (2005) Large scale in vivo synthesis of globotriose and globotetraose by high cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli. Biochimie 87, 197–203]. Here, we found that LgtD has an additional β1,3-galactosyltransferase activity which allows our bacterial system to be extended to the synthesis of the carbohydrate portion of globopentaosylceramide (Galβ-3GalNAcβ-3Galα-4Galβ-4Glc) which reacts with the monoclonal antibody defining the stage-specific embryonic antigen-3. In vitro assays confirmed that LgtD had both β1,3-GalT and β1,3-GalNAcT activities and showed that differences in the affinity for Gb3 and Gb4 explain the specific and exclusive formation of globopentaose

BMC Med

BACKGROUND: Overall survival (OS) is the gold standard endpoint to assess treatment efficacy in cancer clinical trials. In metastatic breast cancer (mBC), progression-free survival (PFS) is commonly used as an intermediate endpoint. Evidence remains scarce regarding the degree of association between PFS and OS. Our study aimed to describe the individual-level association between real-world PFS (rwPFS) and OS according to first-line treatment in female patients with mBC managed in real-world setting for each BC subtype (defined by status for both hormone-receptor [HR] expression and HER2 protein expression/gene amplification). METHODS: We extracted data from the ESME mBC database (NCT03275311) which gathers deidentified data from consecutive patients managed in 18 French Comprehensive Cancer Centers. Adult women diagnosed with mBC between 2008 and 2017 were included. Endpoints (PFS, OS) were described using the Kaplan-Meier method. Individual-level associations between rwPFS and OS were estimated using the Spearman's correlation coefficient. Analyses were conducted by tumor subtype. RESULTS: 20,033 women were eligible. Median age was 60.0 years. Median follow-up duration was 62.3 months. Median rwPFS ranged from 6.0 months (95% CI 5.8-6.2) for HR-/HER2 - subtype to 13.3 months (36% CI 12.7-14.3) for HR + /HER2 + subtype. Correlation coefficients were highly variable across subtypes and first-line (L1) treatments. Among patients with HR - /HER2 - mBC, correlation coefficients ranged from 0.73 to 0.81, suggesting a strong rwPFS/OS association. For HR + /HER2 + mBC patients, the individual-level associations were weak to strong with coefficients ranging from 0.33 to 0.43 for monotherapy and from 0.67 to 0.78 for combined therapies. CONCLUSIONS: Our study provides comprehensive information on individual-level association between rwPFS and OS for L1 treatments in mBC women managed in real-life practice. Our results could be used as a basis for future research dedicated to surrogate endpoint candidates

Bioanalyse et ingénierie de glycosyltransférases

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Rôle de la voie de signalisation MAP kinase Mps1 dans la pathogénie fongique et dans le contrôle de l'intégrité de la paroi

L'intégrité de paroi cellulaire est cruciale pour la survie du champignon pendant son cycle de développement ou en réaction à des conditions de stress. Chez la levure, les voies de signalisation de MAP kinase, Slt2, et calcineurin, régulent la réparation de paroi cellulaire. MPS1, l'orthologue de SLT2, chez Magnaporthe grisea est essentiel pour la réparation de la paroi cellulaire et pour la pénétration de l'appressorium (Xu, et al., 1998). Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6, alors que le calcineurin active Crz1. Par ailleurs, PaIdc1 a un rôle dans la localisation nucléaire de PaMpk1 (orthologue de Slt2 et Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, et al., 2007). MgIDC1, Le gène orthologue de PaIDC1 a été, de même, identifié chez M. grisea. ScAGS1 (a-glucan synthase), est un composant principal de la paroi principal des champignons. CaCAS5, est un régulateur transcriptionel, régule plusieurs gènes de la paroi cellulaire et ScKnr4 est impliqué dans la régulation de l'activité de 1,3- -glucan synthase et la formation de la paroi cellulaire Ces gènes ont été identifiés chez M. grisea et des mutants de délétion ont été construits par le remplacement de gène chez M. grisea. Les mutants Guy11 KU80 mps1 et Guy11 KU80 idc1 montrent une forte réduction de mycélium aérien. Guy11 KU80 mps1, Guy11 KU80 rlm1 et Guy11 KU80 swi4 ont une très forte réduction de sporulation. Guy11 KU80 mps1, Guy11 KU80 rlm1 et Guy11 KU80 crz1 ont une forte réduction de pouvoir pathogène. De plus, les mutants Guy11 KU80 mps1 et Guy11 KU80 swi4 sont inhibé, de 100% en présence d'un mélange de l'Aculéacine et Nikkomycine à faible dose (DI20). Les résultats montrent que chez M. grisea, il existe deux voies impliquées dans l'intégrité de la paroi cellulaire. La voie MAPK MPS1, qui régule les facteurs de transcription Rlm1, Swi4, Swi6 et la voie de Calcineurine, qui régule Crz1. D'après les analyses, SWI4 est impliquée dans la régulation des gènes de glucan synthases et chitine synthase, quand RLM1 n'est impliqué que dans la régulation des gènes de chitine synthase. Dans la voie de Calcineurine, CRZ1 contrôle les gènes de chitine synthase aussi. Ces études suggèrent que les facteurs de transcription qui sont régulés par Mps1 et Calcineurine sont spécialisés dans la régulation des gènes de cible spécifiques à l'intégrité et la réparation de la paroi cellulaire.The cell wall integrity is crucial for the survival of fungi during its development or in reaction in stress conditions. In yeast, the MAP kinase pathway Slt2, and the calcineurin pathway are responsible of the cell wall repair. MPS1, the orthologous of SLT2, in Magnaporthe grisea is essential for the repair of the cell wall and the penetration of the appressorium (Xu, and Al, 1998). In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6, whereas the calcineurin activates Crz1. In addition, PaIdc1 has a role in the nuclear localization of PaMpk1 (orthologous of Slt2 and Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, and Al, 2007), in Podospora anserina. MgIDC1, the gene orthologous of PaIDC1 , likewise, was identified in M. grisea. ScAGS1 (a- glucan synthase), is the principal component of the wall of fungi. CaCAS5, is a transcriptional regulator, controls several genes of the cell wall and ScKnr4 is implied in the regulation of the activity of 1,3- - glucan synthase and the formation of the cell wall These genes was identified at M. grisea and deletion mutants were obtained by the gene replacement in M. grisea. Mutants Guy11 KU80 mps1 and Guy11 KU80 idc1 show a strong reduction of mycelium. Guy11 KU80 mps1, Guy11 KU80 rlm1 and Guy11 KU80 swi4 have a very strong reduction of sporulation. Guy11 KU80 mps1, Guy11 KU80 rlm1 and Guy11 KU80 crz1 have a strong reduction of pathogenicity. Moreover, mutants Guy11 KU80 mps1 and Guy11 KU80 swi4 are 100% inhibited, in presence of a mixture of Aculéacine and Nikkomycine with low dose (DI20). The results show that in M. grisea, there are two pathways implied in the cell wall integrity. The MAPK pathway Mps1, which controls the tr anscription factors Rlm1, Swi4, Swi6 and the calcineurin pathway, which controls the transcription factor, Crz1. According to this study, SWI4 is implied in the regulation of glucan synthases and chitin synthase genes, when RLM1 is implied only in the regulation of chitin synthase genes. In the calcineurin pathway, CRZ1 controls chitin synthase genes. These studies suggest that the factors of transcription which are controlled by Mps1 and Calcineurin are specialized in the regulation of target genes, specific to the cell wall integrity and cell wall repair.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Identification et caractérisation de gènes de glycosyltranférases impliqués dans la biosynthèse des polysaccharides pariétaux

Dans la Nature, le cycle du carbone commence avec la fixation du C02par les plantes photosynthétiques. Une partie se retrouve sous forme de molécules glucidiques qui seront utilisées par la cellule végétale pour construire le réseau de polysaccharides pariétaux. En raison de leur importance économique connue source d'énergie renouvelable, il apparaît essentiel de mieux comprendre les mécanismes cellulaires responsables de leur biosynthèse et donc d'identifier les glycosyltransférases (GTs), les enzymes clé de cette machinerie cellulaire. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'identifier et caractériser la fonction de gènes potentiellement impliqués dans la biogenèse des polysaccharides pariétaux. Une approche bioinformatique innovante a permis d'identifier plus de 150 nouvelles séquences candidates dans le génome de Arabidopsis, dont une vingtaine présentent des signatures peptidiques les apparentant à des GTs. Pour certaines familles de GTs, la modélisation moléculaire a permis de progresser dans la connaissance des relations structure-fonction des GTs. Cette approche a été utilisée pour déterminer les bases moléculaires responsables de la spécificité de substrats des enzymes connues de la famille GT8, ceci afin de faciliter l'annotation des nombreux gènes d'Arabidopsis de fonction inconnue présents dans cette famille. L'effort a porté également sur l'analyse fonctionnelle d'un petit nombre de gènes, à travers l'étude du phénotype et de la composition pariétale de mutants d'Arabidopsis et leur expression en système hétérologue.The carbon cycle in nature starts with fixation of carbon dioxide by photosynthetic plants. Part of the sugar generated is used by the plant cell to synthesize cell wall polysaccharides through the activity of biosynthetic enzymes. The central process of polysaccharide biosynthesis is the action of glycosyltransferases (GTs), the enzymes responsible for the formation of glycosidic bonds. The overall objective of the project is to identify and assign a function to genes possibly involved in the biogenesis of plant cell wall polysaccharides and to determine how they interact in the coordinatOO biosynthesis of highly complex biopolymers. With the objective to identify new Arabidopsis GT genes, a bioinformatic strategy was designed that 100 to the identification of more than 150 candidate protein sequences. Among them, 20 are considerOO as strong candidates since known GT signatures were clearly evidenced. To improve the functional annotation of plant GT genes, we took advantage of structural data available for sorne GT families to further explore the sequence determinants that confer substrate specificities. This approach which relies on the use of molecular modeling methods was applied to the large GT8 family that comprises approximatel~ 40 Arabidopsis GT genes of unknown functioIl. ln addition, we contributed to the functional characterization of selected candidate genes. Our effort concemed a small number of genes that were characterized in the lab through plant mutant analysis and heterologous expression in insect cells.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Recherche et caractérisation de glycosyltransférases impliquées dans la biosynthèse des polysaccharides de la paroi chez Arabidopsis thaliana

La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés NGT pour Nouvelles GlycosylTransférases , présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes a-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1).The plant cell wall not only defines the unique biology of the plants but also have practical applications as feedstock for biomaterials and for the production of biofuels. Plant primary cell wall is mainly composed of cellulose, hemicelluloses and pectins. Significant progress has been made recently in identifying the enzymes involved in plant cell wall biosynthesis, but only a handful of those have been involved in pectin biosynthesis. With the aim of identifying new putative glycosyltransferases (GTs), in lab Hansen et al 2009 designed a bioinformatic strategy and identified a new group of 24 genes called NGT for (Novel Glycosyltransferase) which were considered strong candidates for putative glycosyltransferase activities. In order to determine the putative role of these NGT genes in plant cell wall biosynthesis, we designed a functional genomics strategy, analysing in parallel Arabidopsis T-DNA mutant lines and performing heterologous expression of candidate genes. I have characterized 15 homozygous mutant lines among the group of 24 putative NGT genes through PCR. We analysed the homozygous mutants for phenotypic alteration such as dwarfing or organ malformation and found that some of mutant lines have narrow leaves as compared to Wild type plants. In parallel I have carried out the cell wall chemical analysis of 12 homozygous mutant lines and did not get any strong difference in neutral monosaccharide composition. The detailed and complete analysis (chemical, expression and microscopic analysis) of all the above mentioned genes could have been time consuming and an overwhelming work, so I focused on At5g28910 (named NGT1) which harbours a fucosyltransferase peptide signature and on At5g14550 (named P), a gene belonging to the DUF266 gene family. Homozygous T-DNA mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 lines were analyzed and showed a reduced growth phenotype (leaf area). Leaf area was quantified at various development stages using ImageJ, and showed a 38% reduction in mutants. Additionally, biochemical characterization of the cell wall was performed showing a reduction in neutral monosaccharide contents, like arabinose, rhamnose and galactose in mutant cell wall. Furthermore glycosyl linkage analysis of mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 has shown that 5-Arabinofuranose (5-Araf) and 3,5-Arabinofuranose (3,5-Araf ) contents were decreased as compared to Wild type Col0 cell wall. These results were also confirmed by immunolabeling of stem cross section of mutant and wild type plants. The complementation of the mutant plants through Agrobacterium transformation resulted in the complete restoration of plant phenotype. Taken together, these data suggest that NGT1 could be an arabinosyltransferase. In order to characterize its biochemical activity, the NGT1 protein was heterologously expressed in Pichia pastoris. The recombinant protein was used to perform in vitro activity tests, but we were unable to demonstrate any neither fucosyltransferase (on the basis of peptide signature) nor arabinosyltransferase activity. In parallel to this study, I contributed to the heterologous expression and characterization of two biochemically characterized Arabidopsis GTs involved in xyloglucan synthesis: the fucosyltransferase (AtFUT1) and xylosyltransferase (AtXT1). I have successfully expressed a truncated and active form of AtFUT1, which represents an essential step for further structural studies that will be undertaken in the lab.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Unraveling the complex enzymatic machinery making a key galactolipid in chloroplast membrane: a multiscale computer simulation

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Etude structure-fonction d'une fucosyltransférase (FucTA) de Arabidopsis thaliana

Ce travail cherche à apporter un éclairage sur les relations séquence-structure-fonction des alpha1,3/4-fucosyltransférases, avec un accent particulier sur les core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes. La fucosylation de type Core alpha1,3 est une caractéristique des oligosaccharides N-liés des plantes et invertébrés, avec une fonction biologique qui n'est pas encore élucidée. L'activité Core alpha1,3-fucosyltransférase est responsable d'allergies alimentaires, au pollen, et aux insectes chez l'homme. Dans le cadre de ce travail sont présentés des résultats de caractérisation biochimique (effet de cations divalents sur l'activité, Km de substrat donneur), des expériences de troncation des différents domaines (ex: suppression du domaine C-terminal spécifique aux core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes), et de mutagenèse dirigée, en utilisant comme protéine modèle, la core 1,3-fucosyltransferase A (FucTA) d'Arabidopsis thaliana qui a été exprimée sous forme recombinante chez Pichia pastoris. Ces expériences ont été dictées sur la base de nos résultats d'analyses bioinformatiques des séquences de alpha1,3/4-fucosyltransférases et de la modélisation par homologie du domaine de liaison au nucléotide-sucre de l'enzyme FucTA. La mutagenèse des résidus clé identifiés par cette approche a permis de confirmer l'importance de certains acides aminés dans le mécanisme catalytique. Enfin la protéine FucTA étant elle-même glycosylée quand elle est produite chez P. pastoris, nous avons étudié l'impact de cette glycosylation sur la production et l'activité de la protéine, par des expériences de mutagenèse, de Western blotting et de spectrométrie de masse.This work brings an insight on conserved motifs and sequence similarities of alpha1,3/4-fucosyltransferases with emphasis on plant core alpha1,3-fucosyltransferases. Core alpha1,3-fucosylation is a conserved feature of plant and invertebrate N-linked oligosaccharides with no yet known biological function. Core alpha1,3-fucosyltransferase activity is connected to pollen, food and insect allergies in many patients. Core alpha1,3-fucose is recognised by the immune system as foreign element, since mammals do not produce this epitope. I present the results of biochemical characterisation (such as divalent metal ion dependency and Km for the donor substrate), protein truncation (deletion of the proposed most C-terminal subdomain unique to plant core alpha1,3-fucosyltransferases), protein fusions (of immuno-detection epitopes and His-tag), and site-directed mutagenesis of Arabidopsis thaliana core alpha1,3-fucosyltransferase A (FucTA). Mutagenesis was carried out by alanine replacement of potentially important residues based on our results of bioinformatics analyses and homology modelling (which is also subject of this work). Alanine screening was performed either to investigate the importance of some residues of the donor substrate binding pocket of A. thaliana FucTA or its putative N-glycosylation sites. The latter study was complemented also with mass spectral fingerprinting.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Identification of Putative Rhamnogalacturonan-II Specific Glycosyltransferases in Arabidopsis Using a Combination of Bioinformatics Approaches

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Identification of Putative Rhamnogalacturonan-II Specific Glycosyltransferases in Arabidopsis Using a Combination of Bioinformatics Approaches

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