Functional analysis of the Bunyamwera orthobunyavirus Gc glycoprotein

The virion glycoproteins Gn and Gc of Bunyamwera orthobunyavirus (family Bunyaviridae) are encoded by the M RNA genome segment and have roles in both viral attachment and membrane fusion. To investigate further the structure and function of the Gc protein in viral replication, we generated 12 mutants that contain truncations from the N terminus. The effects of these deletions were analysed with regard to Golgi targeting, low pH-dependent membrane fusion, infectious virus-like particle (VLP) formation and virus infectivity. Our results show that the N-terminal half (453 residues) of the Gc ectodomain (909 residues in total) is dispensable for Golgi trafficking and cell fusion. However, deletions in this region resulted in a significant reduction in VLP formation. Four mutant viruses that contained N-terminal deletions in their Gc proteins were rescued, and found to be attenuated to different degrees in BHK-21 cells. Taken together, our data indicate that the N-terminal half of the Gc ectodomain is dispensable for replication in cell culture, whereas the C-terminal half is required to mediate cell fusion. A model for the domain structure of the Gc ectodomain is proposed

Die Rolle der Gengrenzen in der Transkriptionsregulation von Zaire Ebolavirus

Die sieben Gene des Zaire Ebolavirus (ZEBOV) werden im RNA-Genom durch hoch konservierte Transkriptionsstartsignale und –stoppsignale flankiert. An den Gengrenzen treffen das Stoppsignal des vorangehenden und das Startsignal des nachfolgenden Gens in unterschiedlicher Weise aufeinander. Entweder überlappen die beiden Signale, oder sie sind über nicht transkribierte intergenische Regionen (IRs) variabler Länge und Sequenz getrennt. Nicht segmentierte negativ-strängige RNA-Viren besitzen nur einen am 3’-Ende des Genoms gelegenen Transkriptionspromotor. Einzig die cis-aktiven Signale an den Gengrenzen steuern somit über Interaktion mit dem viralen Polymerasekomplex alle bei der Transkription ablaufenden Prozesse, wie die Termination und Reinitiation der Transkription sowie das Capping und Polyadenylieren der mRNA. Eine Möglichkeit, die Syntheserate viraler mRNA und damit die Produktion viraler Proteine zu regulieren, ist, die Bildung polycistronischer (Readthrough-) mRNAs durch das Überlesen von Transkriptionsstoppsignalen zu induzieren. Diesen wird eine Rolle bei der spezifischen Reduktion einzelner Genprodukte zugeschrieben, da sie schlecht translatiert werden. Solche Transkripte waren bislang für ZEBOV nicht beschrieben, konnten im Rahmen dieser Arbeit jedoch in mit Virus infizierten Zellen nachgewiesen werden. Dabei war interessant, dass sie unabhängig von der Struktur der Gengrenzen, also sowohl bei solchen mit überlappenden als auch mit durch IR getrennten Transkriptionssignalen, gebildet wurden. Um nun der Frage weiter nachzugehen, inwieweit die Transkriptionsaktivität über die unterschiedlich strukturierten Gengrenzen reguliert wird, wurden bicistronische Minigenome eingesetzt. In diesen sind zwei Reportergene durch ZEBOV-spezifische Gengrenzen voneinander separiert. Zunächst wurde die Transkriptionsaktivität von Minigenomen mit unterschiedlichen Wildtyp-Gengrenzen (IR 5nt, IR 144nt und eine Überlappung) untersucht. Dies erfolgte sowohl in mit ZEBOV infizierten Zellen als auch in einem rekonstruierten ZEBOV-spezifischen Replikations- und Transkriptionssystem. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse übereinstimmend auf eine durch die IRs beeinflusste Regulation der Transkription hin, da die Reinitiationsfrequenz bei einer Gengrenze mit einer langen IR am niedrigsten war. Viele Negativstrang-RNA-Viren nutzen die intergenischen Regionen, um die Erkennung der angrenzenden Transkriptionssignale zu regulieren. Da die Transkriptionssignale bei ZEBOV sehr hoch konserviert sind, die IRs jedoch variabel, legte das einen Einfluss auf die Erkennung der angrenzenden Signale nahe. Erstaunlicherweise führte jedoch die Deletion, Substitution oder Verlängerung der beiden untersuchten IRs nicht zu einem Verlust der Genexpression. Daraus folgt, dass die IRs in ZEBOV für die Expression angrenzender Gene nicht essentiell sind. Die Analyse der transkribierten mRNA sowie die Quantifizierung der gebildeten Proteinmenge bestätigten allerdings, dass die IRs die Reinitiationsfrequenz am nachfolgenden Gen regulieren. Die Sequenz der IR konnte dabei als maßgeblicher Faktor ausgeschlossen werden. Vielmehr spielte die IR-Länge eine bedeutende Rolle. Entgegen den Erwartungen ließ sich hierbei keine direkte Korrelation zwischen IR-Länge und Reinitiationsfrequenz feststellen, wie sie für andere Viren beschrieben wird. Vielmehr konnte für beide untersuchten Gengrenzen bei IRs von 10-30 Nukleotiden Länge eine starke Reduktion des Neustartens beobachtet werden, während eine Inhibition der Reinitiation bei IR-Längen von 5 oder >40 Nukleotiden nicht auftrat. Die Hemmung der viralen Polymerase über IRs bestimmter Länge konnte auch in der Virusinfektion bestätigt werden. Eine derartige Regulation ist bislang bei anderen Viren nicht bekannt. Dies könnte auf eine für ZEBOV einmalige Erkennung der Startsignale hindeuten, die von der spezifischen Verpackungseinheit des Genoms abhängig ist. An zwei Gengrenzen im ZEBOV-Genom überlappen die Transkriptionssignale aufeinander folgender Gene, wobei sie sich ein hoch konserviertes Pentamer teilen. Diese Gengrenzstruktur ist für Filoviren einzigartig. Aufgrund der Überlappung trifft die virale Polymerase bei der Transkription zuerst auf das Startsignal des stromabwärts liegenden Gens, bevor sie zu dem Stoppsignal des stromaufwärts liegenden Gens gelangt. Eine Mutation des Transkriptionsstartsignals beeinflusste die Erkennung des überlappenden Transkriptionsstoppsignals nicht. Hingegen war ein funktionelles Stoppsignal essentiell für die Reinitiation am überlappenden Startsignal. Stoppen und Neustarten sind somit in ZEBOV funktionell miteinander verknüpft, was den generellen Ablauf der Transkription nach einem für alle nicht segmentierten negativ-strängigen RNA Viren beschriebenen Modell bestätigen konnte. Eine Insertionsmutagenese an dieser Gengrenze verschob das überlappende Startsignal stromaufwärts. Die Untersuchung der gebildeten mRNA zeigte, dass die filovirale Polymerase in der Lage war, überlappende Transkriptionssignale effizient zu erkennen, die in umgedrehter Reihenfolge durch bis zu 21 Nukleotide getrennt vorlagen. In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass auch die Filoviren bei Stoppen und Neustarten der Transkription einem generell für alle negativ-strängigen nicht segmentierten RNA-Viren vorgeschlagenen Modell zu folgen scheinen. Dennoch weisen die Ergebnisse auf für Filoviren einzigartige, komplexe Regulationsmechanismen hin, die eine spezifische Kontrolle der viralen Polymerase über die an den Gengrenzen gelegenen cis-aktiven Signale nahe legen

The sodium-dependent di- and tricarboxylate transporter, NaCT, is not responsible for the uptake of D-, L-2-hydroxyglutarate and 3-hydroxyglutarate into neurons

Multi-objective evolutionary algorithms (MOEAs) have become increasingly popular as multi-objective problem solving techniques. Most studies of MOEAs are empirical. Only recently, a few theoretical results have appeared. It is acknowledged that more theoretical research is needed. An important open problem is to understand the role of populations in MOEAs. We present a simple bi-objective problem which emphasizes when populations are needed. Rigorous runtime analysis point out an exponential runtime gap between a population-based algorithm (SEMO) and several single individual-based algorithms on this problem. This means that among the algorithms considered, only the populationbased MOEA is successful and all other algorithms fail

Lyophilisation of influenza, rabies and Marburg lentiviral pseudotype viruses for the development and distribution of a neutralisation-assay based diagnostic kit

Pseudotype viruses (PVs) are chimeric, replication-deficient virions that mimic wild-type virus entry mechanisms and can be safely employed in neutralisation assays, bypassing the need for high biosafety requirements and performing comparably to established serological assays. However, PV supernatant necessitates -80°C long-term storage and cold-chain maintenance during transport, which limits the scope of dissemination and application throughout resource-limited laboratories. We therefore investigated the effects of lyophilisation on influenza, rabies and Marburg PV stability, with a view to developing a pseudotype virus neutralisation assay (PVNA) based kit suitable for affordable global distribution. Infectivity of each PV was calculated after lyophilisation and immediate reconstitution, as well as subsequent to incubation of freeze-dried pellets at varying temperatures, humidities and timepoints. Integrity of glycoprotein structure following treatment was also assessed by employing lyophilised PVs in downstream PVNAs. In the presence of 0.5M sucrose-PBS cryoprotectant, each freeze-dried pseudotype was stably stored for 4 weeks at up to 37°C and could be neutralised to the same potency as unlyophilised PVs when employed in PVNAs. These results confirm the viability of a freeze-dried PVNA-based kit, which could significantly facilitate low-cost serology for a wide portfolio of emerging infectious viruses

Virus nomenclature below the species level : a standardized nomenclature for filovirus strains and variants rescued from cDNA

Specific alterations (mutations, deletions, insertions) of virus genomes are crucial for the functional characterization of their regulatory elements and their expression products, as well as a prerequisite for the creation of attenuated viruses that could serve as vaccine candidates. Virus genome tailoring can be performed either by using traditionally cloned genomes as starting materials, followed by site-directed mutagenesis, or by de novo synthesis of modified virus genomes or parts thereof. A systematic nomenclature for such recombinant viruses is necessary to set them apart from wild-type and laboratoryadapted viruses, and to improve communication and collaborations among researchers who may want to use recombinant viruses or create novel viruses based on them. A large group of filovirus experts has recently proposed nomenclatures for natural and laboratory animal-adapted filoviruses that aim to simplify the retrieval of sequence data from electronic databases. Here, this work is extended to include nomenclature for filoviruses obtained in the laboratory via reverse genetics systems. The previously developed template for natural filovirus genetic variant naming,\virus name[(\strain[/)\isolation host-suffix[/ \country of sampling[/\year of sampling[/\genetic variant designation[-\isolate designation[, is retained, but we propose to adapt the type of information added to each field for cDNA clone-derived filoviruses. For instance, the full-length designation of an Ebola virus Kikwit variant rescued from a plasmid developed at the US Centers for Disease Control and Prevention could be akin to ‘‘Ebola virus H.sapiens-rec/COD/1995/Kikwit-abc1’’ (with the suffix ‘‘rec’’ identifying the recombinant nature of the virus and ‘‘abc1’’ being a placeholder for any meaningful isolate designator). Such a full-length designation should be used in databases and the methods section of publications. Shortened designations (such as ‘‘EBOV H.sap/COD/95/ Kik-abc1’’) and abbreviations (such as ‘‘EBOV/Kik-abc1’’) could be used in the remainder of the text, depending on how critical it is to convey information contained in the full-length name. ‘‘EBOV’’ would suffice if only one EBOV strain/variant/isolate is addressed.http://link.springer.com/journal/705hb201

Functional and molecular characterization of Amer3: a new regulator of the Wnt/beta-catenin pathway

Das Tumorsuppressorprotein APC (adenomatous polyposis coli) ist ein wichtiger negativer Regulator des Wnt/beta-catenin-Signalwegs und spielt im Darm eine entscheidende Rolle in der Proliferation und Differenzierung von Epithelzellen. Mutationen, die zu C-terminal verkürzten APC-Molekülen führen, sind die Hauptursache für die Adenom- und Karzinom-Entwicklung in Darmkrebspatienten. Mit Amer1 und Amer2 wurden zwei Plasmamembran-assoziierte APC-Interaktoren identifiziert, welche die Verteilung von APC zwischen Plasmamembran und Mikrotubuli-Zytoskelett regulieren. Sowohl Amer1 als auch Amer2 sind negative Regulatoren des Wnt/beta-catenin-Signalwegs. Amer1 ist notwendig für eine korrekte Embryogenese und Fehlfunktionen der Proteins führen zu Entwicklungsdefekten und der Entstehung von Krankheiten. Amer1-Mutationen wurden in Wilms- Tumoren, kolorektalen Karzinomen und in der erblichen Knochenkrankheit Osteopathia striata berichtet. Amer2 ist notwendig für die korrekte Musterbildung des Gehirns in Xenopus-Embryonen. Ein drittes paraloges Amer-Protein, Amer3, wurde anhand seiner Sequenzähnlichkeit zu Amer1 und Amer2 identifiziert. Auch Amer3 interagiert über zwischen Amer-Proteinen konservierte Sequenzbereiche mit APC, jedoch waren die molekularen Details dieser Interaktion und Funktionen dieses neuen Proteins bisher nicht bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das neue Protein der Amer-Familie, Amer3, zum ersten Mal molekular und funktionell analysiert. Anders als Amer1 und Amer2, lokalisiert Amer3 im Zytoplasma und Zellkern und seine Lokalisation wird durch eine Kernimportsequenz und ein Kernexportsignal reguliert. Wie Amer1 und Amer2 auch, interagiert Amer3 mit APC, rekrutiert dieses jedoch nicht an die Plasmamembran, sondern kann von APC an das Mikrotubuli-Zytoskelett rekrutiert werden. Darüber hinaus wurde Amer3 als neuer Interaktionspartner von Amer1 identifiziert, das Amer3 an die Plasmamembran rekrutiert. Ein weiterer Interaktionspartner von Amer3 ist der negative Wnt- Regulator Conductin (Axin2). Auch eine funktionelle Rolle für Amer3 wurde in dieser Arbeit untersucht: Amer3 enthält eine Transaktivierungsdomäne und in kolorektalen Tumorzellen kann Amer3 die Expression beta-catenin-abhängiger Zielgene fördern. Somit ist Amer3, anders als membranassoziierte Proteine der Amer-Familie, ein positiver Regulator beta-catenin-anhängiger Transkription. Weiterhin wurde eine Amer-induzierte posttranslationale Modifikation von APC als ein funktioneller Aspekt der Interaktion von Amer-Proteinen mit APC untersucht. Die Analyse zeigte, dass überexprimiertes Amer1 und Amer2, nicht aber Amer3, eine Phosphorylierung von APC an Serin 780 induzieren können. Dabei korreliert die Fähigkeit zur Induktion dieser Phosphorylierung mit der Membranassoziation der Amer-Proteine.The APC tumour suppressor protein is an important molecule in the regulation of the Wnt/beta-catenin signalling pathway. APC is necessary for the regulation of proliferation and differentiation in colorectal epithelial cells. Mutations in the APC gene that lead to the expression of C-terminally truncated molecules are the main cause for the development of adenomas in colorectal cancer patients. Recently, two APC interacting proteins, Amer1 and Amer2, that associate with the plasma membrane and regulate the distribution of APC between plasma membrane and the cytoskeleton have been identified. Amer1 and Amer2 are negative regulators of the Wnt/beta-catenin signalling pathway themselves. Amer1 is necessary for proper embryonal development and its deregulation causes developmental defects and diseases. Inactivating mutations in Amer1 have been reported in Wilms tumours, colorectal carcinomas and the inherited bone disease osteopathia striata. Amer2 is needed for regular brain patterning during Xenopus development. A third paralogous Amer protein, Amer3, has been identified and defined by sequence similarities to Amer1 and Amer2. Similar to the other Amer proteins, Amer3 interacts with APC by means of conserved amino acid stretches. However, no details are known about molecular characteristics or the functional relevance of Amer3. In this work, a molecular and functional analysis of Amer3 protein function was carried out. In contrast to the plasma membrane localizing proteins Amer1 and Amer2, Amer3 localizes to the cytoplasm and nucleus of cells. This distribution can be regulated by a functional nuclear import sequence and a nuclear export signal in Amer3. In addition, Amer3 interacts with full length APC and can be recruited to microtubules upon this interaction. Amer3 was also identified as a novel interaction partner of Amer1 which recruits Amer3 to the plasma membrane. Another interaction partner of Amer3 is the negative Wnt regulator Conductin (Axin2). The analysis of Amer3 function revealed that it contains a functional transactivation domain and that it acts as a positive regulator of Wnt/beta-catenin activity in colorectal cancer cells. Moreover, an Amer-induced posttranslational modification of APC as a functional aspect of the APC-Amer protein interaction was analysed. This analysis revealed that overexpressed Amer1 and Amer2, but not Amer3, can induce the phosphorylation of APC at Serine 780 and that the ability of Amer proteins to induce this phosphorylation correlates with their membrane localization

Antriebssystem für einen steuerbaren Sscheinwerfer

Zusammenfassung: Im Rahmen des Projekts "Adaptive Light Control" im Hause BMW wurde in dieser Arbeit ein Antriebskonzept für einen horizontal und vertikal verstellbaren Scheinwerfer entwickelt. Das Antriebssystem beschränkt sich auf den Abblendlichtscheinwerfer, der zum einen durch die vom Gesetzgeber vorgeschriebene Regulierung der Leuchtweite vertikal verstellbar sein muß, zum anderen durch die Realisierung eines Kurvenlichtes horizontal verstellt werden soll. In dieser Arbeit wurden Ideen gesammelt für die Realisierung eines in zwei Richtungen verstellbaren Abblendlichtscheinwerfers. Des weiteren beschäftigt sich diese Arbeit mit der Auswahl der für diese Anwendung notwendigen Antriebe unter Berücksichtigung der vom Kraftfahrzeug vorgeschriebenen Rahmenbedingungen. Das ausgewählte und im einem Muster verwirklichte Antriebssystem nutzt zur horizontalen Verstellung einen Klauenpolschrittmotor mit einem Schrittwinkel von 7,5°. Das Drehmoment dieses Motors wird über ein Stirnradgetriebe übersetzt und über eine Welle, welche in einer Hülse läuft, an den Reflektor gekoppelt. Die vertikale Verstellung erfolgt über einen Linearaktor in Form eines Schrittmotors mit einem Schrittwinkel von 15°. Im Inneren des Rotors läuft eine Spindel, die die Rotation in eine Translation umformt. Der Linearaktor ist über einen Kugelkopf an den Reflektor gekoppelt