In vitro differentiation of mesenchimal stem cells of dogs into osteogenic precursors

O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.The aim of our research was to evaluate the potential for osteogenic differentiation of mesenchimal stem cells (MSC) obtained from dog bone marrow. The MSC were separated using the Ficoll method and cultured under two different conditions: DMEM low glucose or DMEM/F12, both containing L-glutamine, 20% of FBS and antibiotics. MSC markers were tested, confirming CD44+ and CD34- cells with flow cytometry. For osteogenic differentiation, cells were submitted to four different conditions: Group 1, same conditions used for primary cell culture with DMEM supplemented media; Group 2, same conditions of Group 1 plus differentiation inductors Dexametazone, ascorbic acid and β-glicerolphosphate. Group 3, Cells cultured with supplemented DMEM/F12 media, and Group 4, same conditions as in Group 3 plus differentiation inductors Dexametazone, ascorbic acid and β-glicerolphosphate. The cellular differentiation was confirmed using alizarin red and imunostaining with SP7/Osterix antibody. We observed by alizarin staining that calcium deposit was more evident in cells cultivated in DMEM/F12.Furthermore, by SP/7Osterix antibody immunostaining we obtained 1:6 positive cells when using DMEM/F12 compared with 1:12 for low-glucose DMEM. Based on our results, we conclude that the medium DMEM/F12 is more efficient for induction of differentiation of mesenchymal stem cells in canine osteogenic progenitors. This effect is probably due to the greater amount of glucose in the medium and the presence of various amino acids

Long-term expression of hGH(human growth hormone) and LacZ(Beta-galactosidade) genes in vascular smooth muscle cells transduced by retroviral vectors implanted in vascular adventia of rats: establishment of a new model for ex vivo gene teraphy

A proximidade dos vasos sanguineos torna as celulas musculares lisas vasculares(CML) ideais para a terapia genica sistemica. Alem disso, essas celulas tem proporcionado expressao de genes exogenos in vivo por longos periodos. Entretanto, o procedimento usualmente empregado para semear CML transduzidas em arterias desnudas de celulas endoteliais, frequentemente induz a estenose vascular, consequentemente com alto risco para uso em humanos. Nesse trabalho, demonstramos que a adventicia vascular e um local susceptivel para introduzir CML transduzidas para secretar proteinas na corrente sanguinea atraves de um simples procedimento, evitando as complicacoes vasculares pos-operatorias. As CML transduzidas com o vetor retroviral L(GH6)SN, o qual carrega o gene do hormonio do crescimento humano (hGH), foram semeadas na regiao adventicia da porcao abdominal da arteria aorta de ratos atraves da simples injecao da suspensao celular. Baseados na producao de HGH e anticorpos anti-hGH no soro, nos demonstramos que houve producao de hGH por um periodo de, aproximadamente, 2 meses. A expressao genica por um longo periodo tambem foi demonstrada usando o gene bacteriano da enzima b-galactosidase (LacZ). Nos cortes histologicos da aorta, apos coloracao com o cromogeno X-Gal, foram observadas varias celulas azuis na adventicia vascular por, pelo menos, 11 semanas. Em relacao ao vetor construido com o gene hGH sob o controle do promotor da metalotioneins humana (hPMT), verificamos producao de hGH somente por alguns dias in vivo, o qual foi ativado por Zn2+. Com o nosso procedimento de implante celular, nao observamos estenose, trombose ou outras anormalidades vasculares ou fisiologicas em nenhum dos animais experimentados. Esse modelo de transferencia genica ex vivo - Introdução de celulas modificadas em um local que nao e o de sua origem - poderia ser realizado em vasos perifericos de animais de maior porta atraves da simples injecao da suspensao celular. Este procedimento nos permite introduzir um grande numero de celulas modificadas para a producao da quantidades suficientes de proteinas a terapiaBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

Antidepressant Paroxetine Exerts Developmental Neurotoxicity in an iPSC-Derived 3D Human Brain Model

Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) are frequently used to treat depression during pregnancy. Various concerns have been raised about the possible effects of these drugs on fetal development. Current developmental neurotoxicity (DNT) testing conducted in rodents is expensive, time-consuming, and does not necessarily represent human pathophysiology. A human, in vitro testing battery to cover key events of brain development, could potentially overcome these challenges. In this study, we assess the DNT of paroxetine—a widely used SSRI which has shown contradictory evidence regarding effects on human brain development using a versatile, organotypic human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived brain model (BrainSpheres). At therapeutic blood concentrations, which lie between 20 and 60 ng/ml, Paroxetine led to an 80% decrease in the expression of synaptic markers, a 60% decrease in neurite outgrowth and a 40–75% decrease in the overall oligodendrocyte cell population, compared to controls. These results were consistently shown in two different iPSC lines and indicate that relevant therapeutic concentrations of Paroxetine induce brain cell development abnormalities which could lead to adverse effects.publishe