Oxidative Phosphorylation Fueled by Fatty Acid Oxidation Sensitizes Leukemic Stem Cells to Cold

Dependency on mitochondrial oxidative phosphorylation (OxPhos) is a potential weakness for leukemic stem cells (LSC) that can be exploited for therapeutic purposes. Fatty acid oxidation (FAO) is a crucial OxPhos-fueling catabolic pathway for some acute myeloid leukemia (AML) cells, particularly chemotherapy-resistant AML cells. Here, we identified cold sensitivity at 4◦C (cold killing challenge; CKC4), commonly used for sample storage, as a novel vulnerability that selectively kills AML LSCs with active FAO-supported OxPhos while sparing normal hematopoietic stem cells. Cell death of OxPhos-positive leukemic cells was induced by membrane permeabilization at 4◦C; by sharp contrast, leukemic cells relying on glycolysis were resistant. Forcing glycolytic cells to activate OxPhos metabolism sensitized them to CKC4. Lipidomic and proteomic analyses showed that OxPhos shapes the composition of the plasma membrane and introduces variation of 22 lipid subfamilies between cold-sensitive and cold-resistant cells. Together, these findings indicate that steady-state energy metabolism at body temperature predetermines the sensitivity of AML LSCs to cold temperature, suggesting that cold sensitivity could be a potential OxPhos biomarker. These results could have important implications for designing experiments for AML research to avoid cell storage at 4◦C.</p

Etude in vivo du rôle du métabolisme énergétique et mitochondrial dans la résistance thérapeutique des leucémies aiguës myéloïdes

Le traitement des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) reste un défi clinique majeur en raison d'un mauvais pronostic et d'un taux de rechute élevé. Nous avons précédemment montré que la résistance à la cytarabine (AraC) est due à un métabolisme oxydatif mitochondrial (OxPHOS) stimulé, avec une augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) mitochondriales, des métabolites du cycle de Krebs, de l'oxydation des acides gras (FAO) et de la production d'ATP mitochondrial. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet doctoral a été de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cet état OxPHOS élevé et de proposer une thérapie ciblant les cellules LAM résistantes à l'AraC. En premier lieu, nous avons découvert que les mitochondries adaptent de manière très fine le flux lipophagique pour l'ajuster à leurs besoins énergétiques grâce au contrôle des sites de contacts entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MERCs, lieu de formation d'autophagosomes. Sur le plan mécanistique, les mitochondries augmentent les MERCs par le biais du complexe IP3R1-VDAC1-MFN2, ce qui conduit à une augmentation de la formation des autophagosomes et de la dégradation des gouttelettes lipidiques au niveau de ce microdomaine RE-mitochondrie. En conséquence, la concentration en calcium mitochondrial (mCa2+) et la FAO sont augmentées, stimulant l'activité des déshydrogénases mitochondriales dépendantes du Ca2+ et l'OxPHOS pour soutenir la prolifération des cellules de LAM in vitro et in vivo. Cette première étude améliore nos connaissances sur le dialogue et la dynamique des contacts RE-mitochondrie et montre l'importance de l'OxPHOS, de l'autophagie et de la signalisation calcique dans la biologie des LAM. Nous avons ensuite démontré que les cellules résistantes à l'AraC, caractérisées par un métabolisme OxPHOS élevé, présentent une teneur élevée en mCa2+ et une surexpression de BCL2. Ainsi, l'utilisation de l'inhibiteur de BCL2, venetoclax (VEN), améliore l'efficacité anti-leucémique de l'AraC in vitro et in vivo dans des modèles murins de xénogreffes de patients atteints de LAM (PDX). En utilisant des analyses de respirométrie, de cytométrie en flux et de métabolomique, nous avons montré que VEN abroge l'hyperactivation de l'OxPHOS observée lors du traitement à l'AraC, en diminuant la teneur en mCa2+, en métabolites du cycle de Krebs et en diminuant la capacité énergétique des cellules. De plus, le séquençage ARN en cellule unique à partir de cellules de LAM résiduelles dans la moelle osseuse des PDX suivant les mono et bi-thérapies a mis en évidence trois souspopulations cellulaires transcriptionnellement différentes qui apparaissent spécifiquement dans la maladie résiduelle après traitement VEN+AraC. Ces sous-populations sont caractérisées par un enrichissement en gènes de l'organisation mitochondriale, de la migration et de la différenciation, en grande partie régulés par les facteurs de transcription MITF, E2F4 et p53. Il est important de noter que parmi les neuf gènes les plus surexprimés communs à ces trois sous-groupes de cellules, trois codent pour des protéines impliquées dans l'organisation et l'activité du complexe I de la chaîne de transport des électrons (ETCI). En conséquence, cibler la dépendance à l'ETCI des cellules LAM résiduelles à VEN+AraC par un inhibiteur de l'ETCI a considérablement augmenté le temps précédent la rechute in vivo. Cette deuxième étude a ainsi montré que la bithérapie VEN+AraC est une option thérapeutique prometteuse pour améliorer la réponse anti-leucémique de l'AraC. De plus, elle a révélé la dépendance à l'OxPHOS des cellules de LAM résistantes à VEN+AraC et propose de nouvelles options thérapeutiques dans le traitement contre la LAM. En résumé, mes travaux de doctorat révèlent que l'autophagie, l'homéostasie du calcium mitochondrial et BCL2 sont des acteurs clés du métabolisme oxydatif et induisent une dépendance des cellules de LAM à l'OxPHOS, ce qui alimente la résistance thérapeutique.Treating acute myeloid leukemia (AML) still remains a major clinical challenge due to a poor prognosis and a high rate of relapse. We previously showed that cytarabine (AraC) resistance is driven by elevated mitochondrial oxidative metabolism (OxPHOS) with an increase in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, TCA cycle metabolites, fatty acid oxidation (FAO) and mitochondrial ATP production. Therefore, the objective of my thesis project was to better understand molecular mechanism underlying this high oxidative state and propose combination therapy targeting AraC-resistant AML cells. Firstly, we found that mitochondria finely adapted the lipophagic flux to their own demands via the control of mitochondria-ER contact sites (MERCs) tethering. Mechanistically, mitochondria increased MERCs tethering to support ATP demand through the complex IP3R1-VDAC1-MFN2, leading to an increase in autophagosome formation and lipid droplet degradation closely to the ER-mitochondria microdomains. Consequently, increased mitochondrial calcium content and FAO enhanced Ca2+-dependent mitochondrial enzymes and OxPHOS activities to support AML cell proliferation in vitro and in vivo. This first study provides molecular insights into ER-mitochondria crosstalk and expands our understanding of the physiological importance of OxPHOS, autophagy and Ca2+ signaling in AML. We next demonstrated that high mitochondrial Ca2+ (mCa2+) content and high mitochondrially bound BCL2 level is also associated with high OxPHOS state of AraC-resistant cells. Accordingly, the FDA-approved BCL2 inhibitor venetoclax (VEN) enhanced the efficacy of AraC in vitro and in vivo in AML patient-derived xenograft (PDX) models. Using oxygraphic, flow cytometric and metabolomic analyses, we showed that VEN abrogates the hyperactivation of OxPHOS observed upon AraC treatment, especially in decreasing mCa2+ content, TCA cycle metabolites and OxPHOS capacity. Furthermore, single cell RNA-sequencing of residual AML cells purified from PDX bone marrow after single and duplet therapies uncovered three transcriptionally different cell subpopulations that specifically emerge in VEN+AraC residual disease. These subpopulations were characterized by an increase in mitochondrial organization, migration and differentiation, largely driven by MITF, E2F4 and p53 regulons. Importantly, amongst the nine most upregulated genes common to these three cell clusters, three encoded proteins involved in electron transport chain complex I (ETCI). Accordingly, disrupting ETCI dependency of VEN+AraC-persisting AML cells with ETCI inhibitor significantly increased the time-to-relapse in vivo. This second study demonstrated that the duplet combination VEN+AraC is a promising therapeutic avenue to improve anti-AML response to AraC and revealed the OxPHOS dependency of combinatorial therapy VEN+AraC resistance, supporting new combinatory options in AML therapy. In summary, my PhD work highlights that autophagy, mitochondrial calcium homeostasis and BCL2 are key players of oxidative metabolism and induce a dependency of AML cells on OxPHOS that drives drug resistance

In vivo study of the role of energetic and mitochondrial metabolism in the therapeutic resistance of acute myeloid leukemia

Le traitement des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) reste un défi clinique majeur en raison d'un mauvais pronostic et d'un taux de rechute élevé. Nous avons précédemment montré que la résistance à la cytarabine (AraC) est due à un métabolisme oxydatif mitochondrial (OxPHOS) stimulé, avec une augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) mitochondriales, des métabolites du cycle de Krebs, de l'oxydation des acides gras (FAO) et de la production d'ATP mitochondrial. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet doctoral a été de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cet état OxPHOS élevé et de proposer une thérapie ciblant les cellules LAM résistantes à l'AraC. En premier lieu, nous avons découvert que les mitochondries adaptent de manière très fine le flux lipophagique pour l'ajuster à leurs besoins énergétiques grâce au contrôle des sites de contacts entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MERCs, lieu de formation d'autophagosomes. Sur le plan mécanistique, les mitochondries augmentent les MERCs par le biais du complexe IP3R1-VDAC1-MFN2, ce qui conduit à une augmentation de la formation des autophagosomes et de la dégradation des gouttelettes lipidiques au niveau de ce microdomaine RE-mitochondrie. En conséquence, la concentration en calcium mitochondrial (mCa2+) et la FAO sont augmentées, stimulant l'activité des déshydrogénases mitochondriales dépendantes du Ca2+ et l'OxPHOS pour soutenir la prolifération des cellules de LAM in vitro et in vivo. Cette première étude améliore nos connaissances sur le dialogue et la dynamique des contacts RE-mitochondrie et montre l'importance de l'OxPHOS, de l'autophagie et de la signalisation calcique dans la biologie des LAM. Nous avons ensuite démontré que les cellules résistantes à l'AraC, caractérisées par un métabolisme OxPHOS élevé, présentent une teneur élevée en mCa2+ et une surexpression de BCL2. Ainsi, l'utilisation de l'inhibiteur de BCL2, venetoclax (VEN), améliore l'efficacité anti-leucémique de l'AraC in vitro et in vivo dans des modèles murins de xénogreffes de patients atteints de LAM (PDX). En utilisant des analyses de respirométrie, de cytométrie en flux et de métabolomique, nous avons montré que VEN abroge l'hyperactivation de l'OxPHOS observée lors du traitement à l'AraC, en diminuant la teneur en mCa2+, en métabolites du cycle de Krebs et en diminuant la capacité énergétique des cellules. De plus, le séquençage ARN en cellule unique à partir de cellules de LAM résiduelles dans la moelle osseuse des PDX suivant les mono et bi-thérapies a mis en évidence trois souspopulations cellulaires transcriptionnellement différentes qui apparaissent spécifiquement dans la maladie résiduelle après traitement VEN+AraC. Ces sous-populations sont caractérisées par un enrichissement en gènes de l'organisation mitochondriale, de la migration et de la différenciation, en grande partie régulés par les facteurs de transcription MITF, E2F4 et p53.[...]Treating acute myeloid leukemia (AML) still remains a major clinical challenge due to a poor prognosis and a high rate of relapse. We previously showed that cytarabine (AraC) resistance is driven by elevated mitochondrial oxidative metabolism (OxPHOS) with an increase in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, TCA cycle metabolites, fatty acid oxidation (FAO) and mitochondrial ATP production. Therefore, the objective of my thesis project was to better understand molecular mechanism underlying this high oxidative state and propose combination therapy targeting AraC-resistant AML cells. Firstly, we found that mitochondria finely adapted the lipophagic flux to their own demands via the control of mitochondria-ER contact sites (MERCs) tethering. Mechanistically, mitochondria increased MERCs tethering to support ATP demand through the complex IP3R1-VDAC1-MFN2, leading to an increase in autophagosome formation and lipid droplet degradation closely to the ER-mitochondria microdomains. Consequently, increased mitochondrial calcium content and FAO enhanced Ca2+-dependent mitochondrial enzymes and OxPHOS activities to support AML cell proliferation in vitro and in vivo. This first study provides molecular insights into ER-mitochondria crosstalk and expands our understanding of the physiological importance of OxPHOS, autophagy and Ca2+ signaling in AML. We next demonstrated that high mitochondrial Ca2+ (mCa2+) content and high mitochondrially bound BCL2 level is also associated with high OxPHOS state of AraC-resistant cells. Accordingly, the FDA-approved BCL2 inhibitor venetoclax (VEN) enhanced the efficacy of AraC in vitro and in vivo in AML patient-derived xenograft (PDX) models. Using oxygraphic, flow cytometric and metabolomic analyses, we showed that VEN abrogates the hyperactivation of OxPHOS observed upon AraC treatment, especially in decreasing mCa2+ content, TCA cycle metabolites and OxPHOS capacity. Furthermore, single cell RNA-sequencing of residual AML cells purified from PDX bone marrow after single and duplet therapies uncovered three transcriptionally different cell subpopulations that specifically emerge in VEN+AraC residual disease. These subpopulations were characterized by an increase in mitochondrial organization, migration and differentiation, largely driven by MITF, E2F4 and p53 regulons. Importantly, amongst the nine most upregulated genes common to these three cell clusters, three encoded proteins involved in electron transport chain complex I (ETCI). Accordingly, disrupting ETCI dependency of VEN+AraC-persisting AML cells with ETCI inhibitor significantly increased the time-to-relapse in vivo. This second study demonstrated that the duplet combination VEN+AraC is a promising therapeutic avenue to improve anti-AML response to AraC and revealed the OxPHOS dependency of combinatorial therapy VEN+AraC resistance, supporting new combinatory options in AML therapy. In summary, my PhD work highlights that autophagy, mitochondrial calcium homeostasis and BCL2 are key players of oxidative metabolism and induce a dependency of AML cells on OxPHOS that drives drug resistance

Oxidative Phosphorylation Fueled by Fatty Acid Oxidation Sensitizes Leukemic Stem Cells to Cold

Dependency on mitochondrial oxidative phosphorylation (OxPhos) is a potential weakness for leukemic stem cells (LSC) that can be exploited for therapeutic purposes. Fatty acid oxidation (FAO) is a crucial OxPhos-fueling catabolic pathway for some acute myeloid leukemia (AML) cells, particularly chemotherapy-resistant AML cells. Here, we identified cold sensitivity at 4◦C (cold killing challenge; CKC4), commonly used for sample storage, as a novel vulnerability that selectively kills AML LSCs with active FAO-supported OxPhos while sparing normal hematopoietic stem cells. Cell death of OxPhos-positive leukemic cells was induced by membrane permeabilization at 4◦C; by sharp contrast, leukemic cells relying on glycolysis were resistant. Forcing glycolytic cells to activate OxPhos metabolism sensitized them to CKC4. Lipidomic and proteomic analyses showed that OxPhos shapes the composition of the plasma membrane and introduces variation of 22 lipid subfamilies between cold-sensitive and cold-resistant cells. Together, these findings indicate that steady-state energy metabolism at body temperature predetermines the sensitivity of AML LSCs to cold temperature, suggesting that cold sensitivity could be a potential OxPhos biomarker. These results could have important implications for designing experiments for AML research to avoid cell storage at 4◦C.</p

Label-free detection of mitochondrial activity with Microwave Dielectric Spectroscopy Research Article

International audienceMitochondrial bioenergetics contributes to important biological processes and its dysfunction underlies some diseases, but its assessment requires invasive methods involving intracellular staining and chemical inhibitors. In this study, we introduce microwave dielectric spectroscopy (MWDS) as a new non-invasive and label-free method to detect mitochondrial activity in live cells. We show that under electromagnetic radiation with microwaves (0.4-40 GHz), the dielectric properties of living cells are determined by their mitochondrial activity. MWDS instantly detects the mitochondrial depolarization induced by drugs targeting electron transport chain complexes or during the earliest events of the apoptotic process, from a cell suspension of a single microliter. MWDS also discriminates cancer cells with higher mitochondrial activity, an aspect often related to therapeutic resistance in cancer. Thereby, MWDS represents a highly innovative method for non-invasive detection of mitochondrial activity in live cells, with a broad range of applications in biology and medicine

Label-free detection of mitochondrial activity with Microwave Dielectric Spectroscopy Research Article

International audienceMitochondrial bioenergetics contributes to important biological processes and its dysfunction underlies some diseases, but its assessment requires invasive methods involving intracellular staining and chemical inhibitors. In this study, we introduce microwave dielectric spectroscopy (MWDS) as a new non-invasive and label-free method to detect mitochondrial activity in live cells. We show that under electromagnetic radiation with microwaves (0.4-40 GHz), the dielectric properties of living cells are determined by their mitochondrial activity. MWDS instantly detects the mitochondrial depolarization induced by drugs targeting electron transport chain complexes or during the earliest events of the apoptotic process, from a cell suspension of a single microliter. MWDS also discriminates cancer cells with higher mitochondrial activity, an aspect often related to therapeutic resistance in cancer. Thereby, MWDS represents a highly innovative method for non-invasive detection of mitochondrial activity in live cells, with a broad range of applications in biology and medicine

Targeting Myeloperoxidase Disrupts Mitochondrial Redox Balance and Overcomes Cytarabine Resistance in Human Acute Myeloid Leukemia

International audienc

In vivo metabolomic study uncovers distinct metabolic phenotypes of host tissues and predicts oxidative state of acute myeloid leukemia

Background Metabolic adaptation is a hallmark of cancer including acute myeloid leukemia (AML). Tumor microenvironment is also described as an essential support of leukemic metabolism. We explored how systemic and tissue metabolism was rewired in leukemia-bearing mice and upon chemotherapy. Methods Using AML cell line- and primary patient-derived xenograft models, we developed in vivo metabolomics to uncover the metabolic pattern of 10 tissues including plasma, bone marrow, spleen, liver, adipose tissue, lung, pancreas, kidney, heart and muscle. Results In vivo targeted mass spectrometry allowed metabolic characterization of tissues from naïve and AML-xenografted immunocompromised mice. AML xenotransplantation and cytarabine treatment induced AML cell type-dependent global changes in tissue metabolomes. Infiltration of high OxPHOS MOLM14 cells that are intrinsically chemoresistant, induced minor changes in tissue metabolomes. In contrast, low OxPHOS U937 xenograft led to major reprogramming of metabolic tissue niches for survival upon chemotherapy. Interestingly, plasma metabolite signatures could predict the oxidative phenotype of leukemic cells. Conclusion Major metabolic changes in host tissues play a crucial role in tumor xenotransplantation and define their OxPHOS state in AML. Since mitochondrial phenotype is an essential determinant of drug response in AML, plasma metabolite signatures might be novel biomarkers for patient stratification