5 research outputs found
Estudi de la resposta a les radiacions ionitzants de dues lÃnies cel·lulars amb diferent radiosensibilitat
El factor limitant de la dosi aplicada en els tractaments de radioterà pia és la tolerà ncia del teixit normal. Aquesta tolerà ncia mostra variabilitat entre pacients i aproximadament un 5% dels pacients que reben radioterà pia pateixen toxicitat elevada en el teixit normal. Per aquesta raó, s'han dedicat molts esforços en trobar un assaig que pugui predir-la, per poder establir en el futur tractaments de cà ncer individualitzats. Per aconseguir aquest propòsit, és necessari l'estudi dels mecanismes moleculars que determinen la radiosensibilitat. En aquest context, l'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat estudiar la resposta a les radiacions ionitzants (RI) de dues lÃnies cel·lulars limfoblastoides, una lÃnia cel·lular radiosensible (4060, RS) i una altra radioresistent (20037, RR), mitjançant assajos cel·lulars i d'expressió gènica. Primer, es va avaluar la fosforilació de la histona H2AX en les dues lÃnies, utilitzant diferents metodologies microscòpiques i citometria de flux, observant-se sempre majors recomptes de foci de γ-H2AX o un major increment d'intensitat d'immunofluorescència en la lÃnia RS en comparació amb la lÃnia RR. A més, el sistema microscòpic automà tic va ser la metodologia més rà pida pel recompte de foci i per tant va representar una eina molt útil. Segon, es va avaluar la inducció de foci de γ-H2AX i la seva cinètica de desaparició fins a 24 h postirradiació. La lÃnia RS va presentar recomptes significativament superiors de foci en gairebé tots els temps postirradiació analitzats, aixà com una taxa de desaparició més lenta en comparació amb la lÃnia RR. Tercer, es va avaluar la freqüència d'alteracions cromosòmiques completes i incompletes (CCE i ICE, respectivament) en les dues lÃnies 24 h després d'irradiar. La lÃnia RS va mostrar una freqüència significativament major d'ICE en comparació amb la lÃnia RR. Quart, es va analitzar la mortalitat cel·lular induïda per una dosi de 2 Gy, observant-se que era major en la lÃnia RS que en la lÃnia RR. Finalment, es va utilitzar la metodologia QuantSeq per identificar perfils d'expressió gènica diferencial de les dues lÃnies cel·lulars a diferents temps postirradiació. En comparació amb la lÃnia RR, la lÃnia RS presentava una major i prolongada expressió diferencial de gens, tant a les 4 com a les 24 h després d'irradiar. L'anà lisi funcional 24 hores després d'irradiar va mostrar que la lÃnia RS encara presentava gens diferencialment sobreexpressats relacionats amb resposta al dany en el DNA, efectors de p53 i apoptosi, mentre que la lÃnia RR ja no en sobreexpressava. En conjunt, els resultats d'aquesta tesi demostren que les dues lÃnies cel·lulars tenen diferent resposta a les RI i, tot i ser uns resultats preliminars, podrien ser un bon model per avaluar la toxicitat del teixit normal en pacients de cà ncer després de la radioterà pia.The tolerance of the normal tissue represents the limiting factor on the radiation dose given in radiotherapy. There is significant variation between patients in terms of normal tissue toxicity, and about 5% of cancer patients receiving radiotherapy show high toxicity. For that reason, efforts have been focused on searching a predictive assay of normal tissue radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy treatments in the future. To achieve this goal, understanding the molecular mechanisms underlying radiation sensitivity is necessary. In this scenario, the present thesis aimed to study the response to ionizing radiation of two lymphoblastoid cell lines, one radiosensitive (4060, RS) and another radioresistant (20037, RR), using cell-based assays and gene expression analysis. First, quantification of H2AX phosphorylation was assessed using different microscopic methodologies and flow cytometry. The RS cell line always showed higher foci counts and higher levels of immunofluorescence intensity than the RR cell line. The automated microscopy system represented an improvement of the speed for scoring γ-H2AX foci when compared with the other microscopic methodologies. Second, the kinetics of γ-H2AX foci induction and disappearance was evaluated after irradiation up to 24 h. The RS cell line showed significantly higher foci counts for almost all the post-irradiation times tested and a slower rate of their disappearance in comparison with the RR cell line. Third, the frequency of complete and incomplete chromosome aberrations (CCE and ICE, respectively) was scored after irradiation in both cell lines, showing the RS cell line a significantly higher frequency of ICE than the RR cell line. Fourth, radiation-induced cell death was evaluated after 2 Gy irradiation, presenting the RS cell line a higher mortality than the RR cell line. Finally, QuantSeq methodology was used to identify differential gene expression profiles of both cell lines at different post-irradiation times. The RS cell line presented a greater and a prolonged differential expression of genes, both at 4 and 24 h after irradiation, in comparison with the RR cell line. Functional analysis revealed that 24 h after irradiation genes involved in DNA damage response, p53 effectors and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. Collectivelly, the results from this thesis demonstrate that the two cell lines respond differently to ionizing radiation. Although these data are preliminary, they could serve as a model to study normal tissue radiation toxicity of cancer patients
Differences in DNA repair capacity, cell death and transcriptional response after irradiation between a radiosensitive and a radioresistant cell line
Normal tissue toxicity after radiotherapy shows variability between patients, indicating inter-individual differences in radiosensitivity. Genetic variation probably contributes to these differences. The aim of the present study was to determine if two cell lines, one radiosensitive (RS) and another radioresistant (RR), showed differences in DNA repair capacity, cell viability, cell cycle progression and, in turn, if this response could be characterised by a differential gene expression profile at different post-irradiation times. After irradiation, the RS cell line showed a slower rate of γ-H2AX foci disappearance, a higher frequency of incomplete chromosomal aberrations, a reduced cell viability and a longer disturbance of the cell cycle when compared to the RR cell line. Moreover, a greater and prolonged transcriptional response after irradiation was induced in the RS cell line. Functional analysis showed that 24h after irradiation genes involved in "DNA damage response", "direct p53 effectors" and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. The two cell lines showed different response to IR and can be distinguished with cell-based assays and differential gene expression analysis. The results emphasise the importance to identify biomarkers of radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy protocols
Estudi de la resposta a les radiacions ionitzants de dues lÃnies cel·lulars amb diferent radiosensibilitat
El factor limitant de la dosi aplicada en els tractaments de radioterà pia és la tolerà ncia del teixit normal. Aquesta tolerà ncia mostra variabilitat entre pacients i aproximadament un 5% dels pacients que reben radioterà pia pateixen toxicitat elevada en el teixit normal. Per aquesta raó, s’han dedicat molts esforços en trobar un assaig que pugui predir-la, per poder establir en el futur tractaments de cà ncer individualitzats. Per aconseguir aquest propòsit, és necessari l’estudi dels mecanismes moleculars que determinen la radiosensibilitat. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la resposta a les radiacions ionitzants (RI) de dues lÃnies cel·lulars limfoblastoides, una lÃnia cel·lular radiosensible (4060, RS) i una altra radioresistent (20037, RR), mitjançant assajos cel·lulars i d’expressió gènica. Primer, es va avaluar la fosforilació de la histona H2AX en les dues lÃnies, utilitzant diferents metodologies microscòpiques i citometria de flux, observant-se sempre majors recomptes de foci de γ-H2AX o un major increment d’intensitat d’immunofluorescència en la lÃnia RS en comparació amb la lÃnia RR. A més, el sistema microscòpic automà tic va ser la metodologia més rà pida pel recompte de foci i per tant va representar una eina molt útil. Segon, es va avaluar la inducció de foci de γ-H2AX i la seva cinètica de desaparició fins a 24 h postirradiació. La lÃnia RS va presentar recomptes significativament superiors de foci en gairebé tots els temps postirradiació analitzats, aixà com una taxa de desaparició més lenta en comparació amb la lÃnia RR. Tercer, es va avaluar la freqüència d’alteracions cromosòmiques completes i incompletes (CCE i ICE, respectivament) en les dues lÃnies 24 h després d’irradiar. La lÃnia RS va mostrar una freqüència significativament major d’ICE en comparació amb la lÃnia RR. Quart, es va analitzar la mortalitat cel·lular induïda per una dosi de 2 Gy, observant-se que era major en la lÃnia RS que en la lÃnia RR. Finalment, es va utilitzar la metodologia QuantSeq per identificar perfils d’expressió gènica diferencial de les dues lÃnies cel·lulars a diferents temps postirradiació. En comparació amb la lÃnia RR, la lÃnia RS presentava una major i prolongada expressió diferencial de gens, tant a les 4 com a les 24 h després d’irradiar. L’anà lisi funcional 24 hores després d’irradiar va mostrar que la lÃnia RS encara presentava gens diferencialment sobreexpressats relacionats amb resposta al dany en el DNA, efectors de p53 i apoptosi, mentre que la lÃnia RR ja no en sobreexpressava. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi demostren que les dues lÃnies cel·lulars tenen diferent resposta a les RI i, tot i ser uns resultats preliminars, podrien ser un bon model per avaluar la toxicitat del teixit normal en pacients de cà ncer després de la radioterà pia.The tolerance of the normal tissue represents the limiting factor on the radiation dose given in radiotherapy. There is significant variation between patients in terms of normal tissue toxicity, and about 5% of cancer patients receiving radiotherapy show high toxicity. For that reason, efforts have been focused on searching a predictive assay of normal tissue radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy treatments in the future. To achieve this goal, understanding the molecular mechanisms underlying radiation sensitivity is necessary. In this scenario, the present thesis aimed to study the response to ionizing radiation of two lymphoblastoid cell lines, one radiosensitive (4060, RS) and another radioresistant (20037, RR), using cell-based assays and gene expression analysis. First, quantification of H2AX phosphorylation was assessed using different microscopic methodologies and flow cytometry. The RS cell line always showed higher foci counts and higher levels of immunofluorescence intensity than the RR cell line. The automated microscopy system represented an improvement of the speed for scoring γ-H2AX foci when compared with the other microscopic methodologies. Second, the kinetics of γ-H2AX foci induction and disappearance was evaluated after irradiation up to 24 h. The RS cell line showed significantly higher foci counts for almost all the post-irradiation times tested and a slower rate of their disappearance in comparison with the RR cell line. Third, the frequency of complete and incomplete chromosome aberrations (CCE and ICE, respectively) was scored after irradiation in both cell lines, showing the RS cell line a significantly higher frequency of ICE than the RR cell line. Fourth, radiation-induced cell death was evaluated after 2 Gy irradiation, presenting the RS cell line a higher mortality than the RR cell line. Finally, QuantSeq methodology was used to identify differential gene expression profiles of both cell lines at different post-irradiation times. The RS cell line presented a greater and a prolonged differential expression of genes, both at 4 and 24 h after irradiation, in comparison with the RR cell line. Functional analysis revealed that 24 h after irradiation genes involved in DNA damage response, p53 effectors and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. Collectivelly, the results from this thesis demonstrate that the two cell lines respond differently to ionizing radiation. Although these data are preliminary, they could serve as a model to study normal tissue radiation toxicity of cancer patients
Estudi de la resposta a les radiacions ionitzants de dues lÃnies cel·lulars amb diferent radiosensibilitat
El factor limitant de la dosi aplicada en els tractaments de radioterà pia és la tolerà ncia del teixit normal. Aquesta tolerà ncia mostra variabilitat entre pacients i aproximadament un 5% dels pacients que reben radioterà pia pateixen toxicitat elevada en el teixit normal. Per aquesta raó, s’han dedicat molts esforços en trobar un assaig que pugui predir-la, per poder establir en el futur tractaments de cà ncer individualitzats. Per aconseguir aquest propòsit, és necessari l’estudi dels mecanismes moleculars que determinen la radiosensibilitat. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la resposta a les radiacions ionitzants (RI) de dues lÃnies cel·lulars limfoblastoides, una lÃnia cel·lular radiosensible (4060, RS) i una altra radioresistent (20037, RR), mitjançant assajos cel·lulars i d’expressió gènica. Primer, es va avaluar la fosforilació de la histona H2AX en les dues lÃnies, utilitzant diferents metodologies microscòpiques i citometria de flux, observant-se sempre majors recomptes de foci de γ-H2AX o un major increment d’intensitat d’immunofluorescència en la lÃnia RS en comparació amb la lÃnia RR. A més, el sistema microscòpic automà tic va ser la metodologia més rà pida pel recompte de foci i per tant va representar una eina molt útil. Segon, es va avaluar la inducció de foci de γ-H2AX i la seva cinètica de desaparició fins a 24 h postirradiació. La lÃnia RS va presentar recomptes significativament superiors de foci en gairebé tots els temps postirradiació analitzats, aixà com una taxa de desaparició més lenta en comparació amb la lÃnia RR. Tercer, es va avaluar la freqüència d’alteracions cromosòmiques completes i incompletes (CCE i ICE, respectivament) en les dues lÃnies 24 h després d’irradiar. La lÃnia RS va mostrar una freqüència significativament major d’ICE en comparació amb la lÃnia RR. Quart, es va analitzar la mortalitat cel·lular induïda per una dosi de 2 Gy, observant-se que era major en la lÃnia RS que en la lÃnia RR. Finalment, es va utilitzar la metodologia QuantSeq per identificar perfils d’expressió gènica diferencial de les dues lÃnies cel·lulars a diferents temps postirradiació. En comparació amb la lÃnia RR, la lÃnia RS presentava una major i prolongada expressió diferencial de gens, tant a les 4 com a les 24 h després d’irradiar. L’anà lisi funcional 24 hores després d’irradiar va mostrar que la lÃnia RS encara presentava gens diferencialment sobreexpressats relacionats amb resposta al dany en el DNA, efectors de p53 i apoptosi, mentre que la lÃnia RR ja no en sobreexpressava. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi demostren que les dues lÃnies cel·lulars tenen diferent resposta a les RI i, tot i ser uns resultats preliminars, podrien ser un bon model per avaluar la toxicitat del teixit normal en pacients de cà ncer després de la radioterà pia.The tolerance of the normal tissue represents the limiting factor on the radiation dose given in radiotherapy. There is significant variation between patients in terms of normal tissue toxicity, and about 5% of cancer patients receiving radiotherapy show high toxicity. For that reason, efforts have been focused on searching a predictive assay of normal tissue radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy treatments in the future. To achieve this goal, understanding the molecular mechanisms underlying radiation sensitivity is necessary. In this scenario, the present thesis aimed to study the response to ionizing radiation of two lymphoblastoid cell lines, one radiosensitive (4060, RS) and another radioresistant (20037, RR), using cell-based assays and gene expression analysis. First, quantification of H2AX phosphorylation was assessed using different microscopic methodologies and flow cytometry. The RS cell line always showed higher foci counts and higher levels of immunofluorescence intensity than the RR cell line. The automated microscopy system represented an improvement of the speed for scoring γ-H2AX foci when compared with the other microscopic methodologies. Second, the kinetics of γ-H2AX foci induction and disappearance was evaluated after irradiation up to 24 h. The RS cell line showed significantly higher foci counts for almost all the post-irradiation times tested and a slower rate of their disappearance in comparison with the RR cell line. Third, the frequency of complete and incomplete chromosome aberrations (CCE and ICE, respectively) was scored after irradiation in both cell lines, showing the RS cell line a significantly higher frequency of ICE than the RR cell line. Fourth, radiation-induced cell death was evaluated after 2 Gy irradiation, presenting the RS cell line a higher mortality than the RR cell line. Finally, QuantSeq methodology was used to identify differential gene expression profiles of both cell lines at different post-irradiation times. The RS cell line presented a greater and a prolonged differential expression of genes, both at 4 and 24 h after irradiation, in comparison with the RR cell line. Functional analysis revealed that 24 h after irradiation genes involved in DNA damage response, p53 effectors and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. Collectivelly, the results from this thesis demonstrate that the two cell lines respond differently to ionizing radiation. Although these data are preliminary, they could serve as a model to study normal tissue radiation toxicity of cancer patients
Differences in DNA repair capacity, cell death and transcriptional response after irradiation between a radiosensitive and a radioresistant cell line
Normal tissue toxicity after radiotherapy shows variability between patients, indicating inter-individual differences in radiosensitivity. Genetic variation probably contributes to these differences. The aim of the present study was to determine if two cell lines, one radiosensitive (RS) and another radioresistant (RR), showed differences in DNA repair capacity, cell viability, cell cycle progression and, in turn, if this response could be characterised by a differential gene expression profile at different post-irradiation times. After irradiation, the RS cell line showed a slower rate of γ-H2AX foci disappearance, a higher frequency of incomplete chromosomal aberrations, a reduced cell viability and a longer disturbance of the cell cycle when compared to the RR cell line. Moreover, a greater and prolonged transcriptional response after irradiation was induced in the RS cell line. Functional analysis showed that 24h after irradiation genes involved in "DNA damage response", "direct p53 effectors" and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. The two cell lines showed different response to IR and can be distinguished with cell-based assays and differential gene expression analysis. The results emphasise the importance to identify biomarkers of radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy protocols