Mechanisms of activation of the guanine nucleotide exchange factor C3G

[EN] C3G (also known as RapGEF1) is a ubiquitously expressed guanine nucleotide exchange factor (GEF) that activates mainly the small GTPase Rap1 to promote integrin-mediated cell adhesion. C3G also regulates cell migration, actin remodeling, proliferation, apoptosis, differentiation, and exocytosis. C3G is a modular protein with three structurally and functionally distinct regions. The N-terminal domain (NTD) interacts with E-cadherin and participates in the self-regulation of C3G. The central or SH3b region is mostly flexible and is involved in protein-protein interactions. This region contains five proline-rich motifs (PRMs), P0 to P4, which are binding sites for SH3 domains. The Crk and CrkL adaptor proteins bind to four of these sites (P1, P2, P3 and P4). The C-terminal part contains a REM and a Cdc25H domain that form the catalytic region. The GEF activity of C3G is regulated by two intramolecular interactions. First, binding of the NTD to the REM domain contributes positively to the activity of C3G. Secondly, the C-terminal segment of the SH3b downstream the P3 is an autoinhibitory region (AIR) that binds to the Cdc25HD and blocks the GEF activity. C3G is physiologically activated in response to stimuli that operate through the activation of tyrosine kinases. These signals induce the recruitment of C3G to signaling sites at the membrane, which is mediated by Crk proteins. Activation of the GEF activity of C3G involves tyrosine phosphorylation by Src family and other kinases, and the interaction with Crk proteins. Despite the general processes involved in C3G activation were known, the detailed mechanisms were poorly understood. In this Thesis, we have combined biochemical, biophysical and cell biology approaches to gain understanding of the structural and mechanistic basis of the autoinhibition and physiological activation mechanism of C3G activation within the C3G-Rap1 pathway. We have demonstrated that CrkL binds differentially to the PRMs P1, P2, P3 and P4 in full-length C3G. In resting conditions, sites P1 and P2 are constitutively fully accessible. Exposure of the P3 site is linked to the activation state of C3G. The P4 site is partially accessible independently of the activation state of C3G. The sites P1 and P2 do not participate in the direct activation of C3G. Instead, these sites participate in the constitutive interaction with Crk proteins in HEK293T and Jurkat cell lines, and are required for the recruitment of C3G to the plasma membrane upon TCR stimulation of Jurkat cells. Binding of CrkL to the P3 and P4 is required and sufficient for the direct activation of C3G by CrkL through the release of the autoinhibitory interaction. Binding of CrkL to the P3 is the main activation event. Collectively, P1 and P2 are recruitment sites and P3 and P4 are activation sites. Tyrosine phosphorylation of C3G alone causes minimal activation, yet it is essential for the Crk-mediated stimulation. Phosphorylation by Src sensitizes C3G, which is activated at lower concentrations of CrkL and to higher activity levels than unphosphorylated C3G. We have mapped the main Src phosphorylation sites in C3G at Y329, Y504, Y579 and Y590. Despite CrkL interacts with the P3 and P4 primarily by the SH3N domain, the SH2 and SH3C domains of CrkL also contribute to the activation of C3G. In particular, the SH2 domain plays a key role in the activation of phosphorylated-C3G through a non-canonical low affinity interaction with phospho-Y590, which apparently stabilizes the interaction of CrkL with the activation sites. We have also shown that CrkL induces a stronger activation of C3G than CrkII, and these differences are apparently due to the different inter-domain arrangements of Crk proteins. We have also produced an experimentally validated structural model of autoinhibited C3G, which revealed additional contacts of the AIR with the REM domain. Based on the results, propose a multi-step cycle for the physiological activation and de-activation of C3G. Finally, we have applied the structural and functional data to identify three cancer somatic missense mutations that cause constitutive activation of C3G: Y570N and Y590N were found in non-Hodgkin lymphoma patients, and Y579C was described in a thyroid carcinoma. These mutations expand the repertoire of acquired alterations that deregulate C3G-Rap1 in cancers. In summary, the results of this Thesis contribute to understand the mechanisms of C3G-Rap1 signaling in healthy tissues and in diseases. [ES] C3G (RapGEF1) es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) expresado de forma ubicua que activa principalmente la pequeña GTPasa Rap1 promoviendo la adhesión celular mediada por integrinas. C3G también regula migración celular, remodelación de actina, proliferación, apoptosis, diferenciación y exocitosis. C3G es una proteína modular con tres regiones estructural y funcionalmente diferenciadas. El dominio N-terminal (NTD) interacciona con E-cadherina y participa en la autorregulación de C3G. La región central o SH3b es mayoritariamente flexible y participa en las interacciones proteína-proteína. Esta región contiene cinco motivos ricos en prolina (PRM), P0 a P4, que son sitios de unión para dominios SH3. Las proteínas adaptadoras Crk y CrkL se unen a cuatro de estos sitios (P1, P2, P3 y P4). La zona C-terminal contiene un dominio REM y un dominio Cdc25H que forman la región catalítica. La actividad GEF de C3G está regulada por dos interacciones intramoleculares. En primer lugar, la unión del NTD al dominio REM contribuye positivamente a la actividad de C3G. En segundo lugar, el segmento C-terminal de SH3b tras el P3 es una región autoinhibitoria (AIR) que se une al Cdc25HD y bloquea la actividad del GEF. C3G se activa fisiológicamente en respuesta a estímulos que operan mediante la activación de tirosina quinasas. Estas señales inducen el reclutamiento de C3G a sitios de señalización en la membrana, este proceso está mediado por proteínas Crk. La activación de la actividad GEF de C3G implica su fosforilación en tirosina quinasas de la familia Src y otras quinasas, y la interacción con las proteínas Crk. A pesar de que se conocían los procesos generales implicados en la activación de C3G, los mecanismos detallados no se comprendían bien. En esta Tesis, hemos combinado enfoques bioquímicos, biofísicos y de biología celular para caracterizar las bases estructurales y mecanísticas de los mecanismos de autoinhibición y activación fisiológica de la activación de C3G dentro de la vía C3G-Rap1. Hemos demostrado que CrkL se une de manera diferencial a los PRMs P1, P2, P3 y P4 en C3G completo. En condiciones de reposo, los sitios P1 y P2 están constitutiva y totalmente accesibles. La exposición del sitio P3 está relacionada con el estado de activación de C3G. El sitio P4 está parcialmente accesible independientemente del estado de activación de C3G. Los sitios P1 y P2 no participan en la activación directa de C3G. En cambio, estos sitios median la unión constitutiva con las proteínas Crk en las líneas celulares HEK293T y Jurkat, y son necesarios para el reclutamiento de C3G a la membrana plasmática tras la estimulación de TCR en células Jurkat. La unión de CrkL a P3 y P4 es necesaria y suficiente para la activación directa de C3G por CrkL causando la liberación de la interacción autoinhibitoria. La unión de CrkL al P3 es el principal evento de activación. Colectivamente, P1 y P2 son sitios de reclutamiento y P3 y P4 son sitios de activación. La fosforilación de C3G en tirosinas por sí sola causa una activación mínima, pero es esencial para la estimulación mediada por Crk. La fosforilación por Src sensibiliza a C3G, que se activa a concentraciones más bajas de CrkL y a niveles de actividad más altos que cuando C3G no está fosforilado. Hemos mapeado los principales sitios de fosforilación de Src en C3G, resultando en Y329, Y504, Y579 e Y590. A pesar de que CrkL interactúa con P3 y P4 principalmente mediante el dominio SH3N, los dominios SH2 y SH3C de CrkL también contribuyen a la activación de C3G. En particular, el dominio SH2 juega un papel clave en la activación de C3G fosforilado a través de una interacción no canónica de baja afinidad con fosfo-Y590, la cual aparentemente estabiliza la interacción de CrkL con los sitios de activación. También hemos demostrado que CrkL induce una activación más fuerte de C3G que CrkII, y estas diferencias parecen deberse a la diferente organización entre-dominios de las proteínas Crk. También hemos producido un modelo estructural validado experimentalmente de C3G autoinhibido, que reveló contactos adicionales del AIR con el dominio REM. En base a los resultados, proponemos un ciclo multi-etapa de la activación y desactivación fisiológica de C3G. Finalmente, hemos aplicado los datos estructurales y funcionales para identificar tres mutaciones somáticas de cambio de sentido en cáncer que causan la activación constitutiva de C3G: Y570N e Y590N están descritas en pacientes con linfoma no Hodgkin, y Y579C se había detectado en un carcinoma de tiroides. Estas mutaciones amplían el repertorio de alteraciones adquiridas que desregulan C3G-Rap1 en tumores. En resumen, los resultados de esta Tesis contribuyen a comprender los mecanismos de señalización de C3G-Rap1 en tejidos sanos y en enfermedades

Influencia de la fricción en la evaluación del módulo de cizalladura intralaminar en el ensayo Iosipescu

II CONGRESO NACIONAL DE MATERIALES COMPUESTOS. Celebrado en Madrid, 25 al 28 de noviembre, 1997En este trabajo se realiza un estudio de la influencia que la presencia de fricción entre mordazas y probeta tiene sobre la evaluación del módulo de cizalladura intralaminar mediante el ensayo losipescu. Para ello se na utilizado un algoritmo de contacto, basado en el Método de los Elementos de Contorno, desarrollado por los autores con la característica principal de permitir discretizaciones diferentes en cada sólido. Se han analizado las componentes tensionales en el punto central de la probeta, la evolución entre las entallas y las distribuciones de tensiones en las zonas de contacto.In this work an analysis of the influence that friction has in the evaluation of the intralaminar shear modulus by the losipescu test has been performed. A contact algorithm allowing independent discretizations in the bodies in contact is applied, the algorithm being based on the Boundary Element Method. Stress components at the central point of the specimen, stress evoliztion beiween the notches and stress distribution on the contact zones are analized

Análisis de postpandeo de un panel rigidizado de material compuesto mediante técnicas de modelado multi-global-local incluyendo daño interlaminar

XI CONGRESO NACIONAL DE MATERIALES COMPUESTOS. Celebrado en Móstoles los días 6, 7 y 8 de julio de 2015El uso de paneles rigidizados de material compuesto ha sido incorporado en numerosas aplicaciones. En las situaciones en las que las cargas originan estados tensionales de compresión, éstas pueden producir fenómenos de pandeo local. Una vez superada la carga crítica, a lo largo de la evolución de postpandeo, el desarrollo de dichas inestabilidades puede generar la aparición de daño en el componente, causando el colapso estructural del mismo. Este trabajo presenta el análisis numérico y experimental de un panel multi-rigidizado de material compuesto hasta el colapso. El estudio numérico es llevado a cabo a través de metodologías global-local incluyendo elementos finitos cohesivos para el modelado del daño interlaminar piel-rigidizador.Ministerio de Economía y Competitividad DPI2012-37187Junta de Andalucía TEP-709

La evaluación técnica de la innovación en los productos de construcción. Panorama actual y perspectivas de futuro.

El sector de la construcción ha contribuido de forma notable al consumo de recursos, energía y producción de emisiones y residuos, siendo necesario elaborar herramientas específicas de control de esta actividad productiva y constructiva. Entre otras, la directiva de Productos de Construcción (DPC). La Innovación y la Calidad en la Construcción actualmente se están viendo afectadas por la derogación de la DPC a través del Nuevo Reglamento de Productos de la Construcción (RPC), publicado el 9 de marzo de 2011, y cuya entrada en vigor se establece el próximo 1 de julio del presente año 2013. El marcado CE y los DITEs sufren una reestructuración en favor de la Declaración de Prestación –responsable- por parte del fabricante. Esta Declaración contendrá información sobre el uso previsto del producto, así como una lista de características esenciales relacionadas con dicho uso, y la definición de al menos una prestación de las citadas características esenciales. Los objetivos de este Nuevo Reglamento son claros: abogar por una libre circulación del producto por la UE, el reconocimiento común de los documentos y la unificación de métodos de evaluación. Además, promueve la Vigilancia de Mercado y acepta criterios de evaluación simplificados. A nivel metodológico, se replantea la evaluación técnica, incidiendo principalmente sobre la Emisión y contenido de Sustancias Peligrosas (RB3), sobre Ahorro Energético y Conservación del Calor (RB6) y el Uso Sostenible de los Recursos Naturales (RB7). Este último requisito se estructura desde tres puntos de vista: a) la reutilización y la reciclabilidad; b) la durabilidad; c) la utilización de materias primas y materiales secundarios. Los fabricantes de productos innovadores deben conocer el impacto ambiental de la producción, desde la extracción de la materia prima hasta la salida de fábrica, así como las posibilidades de la reutilización de subproductos o de la retirada y potencial reciclaje de los residuos generados. Es necesario concretar la metodología que permita evaluar este punto principalmente en todos los Documentos de Idoneidad Técnica Europeos, puesto que será de obligado cumplimiento a partir de julio de 2013. En esta línea, las Declaraciones Ambientales de Producto (DAP) son ecoetiquetas que evalúan de forma cuantitativa diversos parámetros sobre el impacto ambiental del producto, basándose en la metodología del Análisis de Ciclo de Vida (ACV). Si bien el RPC sugiere esta metodología de las DAPs para justificar el cumplimiento del RB7, necesitaría una seria revisión desde el punto de vista metodológico para su aplicación en productos, sistemas y procedimientos constructivos innovadores. Las cuestiones instrumentales son clave en la discusión de la definición metodológica sobre el modo de evaluar el Uso Sostenible de los Recursos Naturales (RB7), en el ámbito de los Documentos de Idoneidad Técnica Europeos

Análisis numérico de pandeo de paneles rigidizados de material compuesto

COMATCOMP 09 : Donostia - San Sebastian, 7, 8 y 9 de octubre de 2009Uno de los elementos estructurales que mayor interés ha despertado en las últimas décadas para su fabricación con materiales compuestos han sido los paneles rigidizados empleados en los recubrimientos de los fuselajes, estabilizadores y alas de las aeronaves. Estos componentes están formados por una lámina o piel delgada a la que se unen rigidizadores, siendo las secciones transversales más habituales las secciones tipo T, I y W, para aportarle la rigidez necesaria. La configuración de los paneles hace que sean estructuras muy sensibles a fenómenos de inestabilidad, fundamentalmente por abolladuras de la pie aunque ello no supongan el fallo del componente. Para aprovechar esta característica, los criterios de diseño permiten sobrepasar la primera carga de pandeo en un cierto margen. El objetivo de este trabajo es el análisis mediante simulaciones numéricas de las cargas y modos de pandeo de un panel rigidizado cilíndrico de material compuesto. El panel considerado tiene dispuestos dos rigidizadores en dirección circunferencial con sección transversal en W y se encuentra sometido a una presión uniforme sobre la piel. La resolución numérica de la estructura se ha realizado a través del programa de Elementos Finitos ABAQUS/Standard, usando elementos lineales tipo lámina de integración reducida para la discretización de la estructura. En esta investigación se han llevado a cabo diversas variaciones de ciertos parámetros del sistema, concretamente la secuencia de apilado de las láminas y la distancia entre rigidizadores, para proceder a realizar un análisis de la influencia de los mismos en las cargas y modos de pandeo del componente.Junta de Andalucía P06-TEP- 0204

Fluidization of Group B particles with a rotating distributor

A novel rotating distributor fluidized bed is presented. The distributor is a rotating perforated plate, with 1% open-area ratio. This work evaluates the performance of this new design, considering pressure drop, Δp, and quality of fluidization. Bed fluidization was easily achieved with the proposed device, improving the solid mixing and the quality of fluidization. In order to examine the effect of the rotational speed of the distributor plate on the hydrodynamic behavior of the bed, minimum fluidization velocity, Umf, and pressure fluctuations were analyzed. Experiments were conducted in the bubbling free regime in a 0.19 m i.d. fluidized bed, operating with Group B particles according to Geldart's classification. The pressure drop across the bed and the standard deviation of pressure fluctuations, σp, were used to find the minimum fluidization velocity, Umf. A decrease in Umf is observed when the rotational speed increases and a rise in the measured pressure drop was also found. Frequency analysis of pressure fluctuations shows that fluidization can be controlled by the adjustable rotational speed, at several excess gas velocities. Measurements with several initial static bed heights were taken, in order to analyze the influence of the initial bed mass inventory, over the effect of the distributor rotation on the bed hydrodynamics.Publicad

Genexput: A rapid and standarised method for large genome expansion of Pseudomonas putida

The soil bacteria Pseudomonas putida has gained considerable interest in recent years due to its metabolic complexity, which gives the bacteria huge potential in fields as diverse as bioremediation and bio-based industrial production of chemicals [1]. However, the full exploitation of P. putida potential requires of the development of standarised and hightrouput large genome edditing methods in this bacterium. Actual synbiotools for this purpose in P. putida are still in its infancy and need to be optimised. For instance, well-known state-of-the-art methods such as recombineering and CRISPR-Cas approachs have yet low efficiency in this bacteria [2]. In an attemp to address this important shorcoming in the portfolio of P. putida synbiotools, we have constructed a pSEVA-based [3] library of vectors which allows the genome integration via homologous recombination of large fragments of exogenous DNA. Thereof, loci distributed all along the genome were selected and designed as landing paths for the integration of alien DNA. This way it is possible to add an additional level of gene expression control at genome localization level. We further validated our approach by i) monitoring the expression level of a single GFP reported gene along the genome localization and ii) by expanding the metabolic versatility of P.putida KT2440 towards toluene and m-xylene by integrating in its chromosome the genes encoded in the pWWO plasmid. In summary we provide an efficient toolkit that allows a rapid genome expansion of P. putida while allowing the expression level of the desired transgene

Adaptation of the Electric Machines Learning Process to the European Higher, Education Area

In this paper the basic lines of a complete teaching methodology that has been developed to adaptthe electric machines learning process to the European Higher Education Area (EHEA) arepresented. New teaching materials that are specific to Electric Machines have been created(textbooks, self-learning e-books, guidelines for achieving teamwork research, etc.). Working ingroups has been promoted, as well as problem solving and self-learning exercises, all of which areevaluated in a way that encourages students' participation. Finally, the students' learning process inthe lab has been improved by the development both of a new methodology to follow in the lab andnew workbenches with industrial machines that are easier to use and also enable the labexperiments to be automated. Finally, the first results obtained as a result of applying the proposedmethodology are presented