Unravelling the molecular bases of carotenoid biosynthesis in maize

My research program focused on the elucidation of the mechanisms of carotenoid accumulation in maize (Zea mays). I amplified a putative carotenoid ε-hydroxylase, named CYP97C19, from the yellow maize variety B73. Metabolic profiling of the carotenoid pathway in Arabidopsis lut1 mutant (lacking lutein) overexpressing maize CYP97C19 confirmed the accumulation of lutein in transgenic lines at the expense of zeinoxanthin. This allowed me to conclude that maize CY P97C19 is a functional ε-hydroxylase. In a separate experiment, I characterized two transgenic lines overexpressing the Arabidopsis Orange gene (AtOR). Both lines exhibited an increase in carotenoid content without any concomitant upregulation of endogenous carotenogenic gene expression. The highest carotenoid accumulating line was crossed with different transgenic lines with diverse carotenoid profiles. In cases in which the original transgenic parent that was crossed with the AtOr line accumulated low levels of total carotenoids, resulting hybrids exhibited a substantial increase of total carotenoid content without any changes in the qualitative carotenoid composition. No changes at the metabolite and transcript profiles were observed in the hybrids when the carotenoid content in the original parents used to cross with the AtOr line was high. Results from these experiments suggest that one of the functions of the Orange gene in maize endosperm is to generate a metabolic sink for carotenoids. Results from experiments in which carotenoid β-hydroxylase (BCH1 and BCH2) was silenced in genotypes able to accumulate high lutein and high zeaxanthin levels indicated that these genes are determinans of β-carotene and zeaxanthin accumulation. I also investigated the interactions between the carotenoid and starch biosynthetic pathways as they share common precursors. I analyzed total starch content in four transgenic maize lines: one line overexpressing AtOR (L1) and three lines expressing different carotenogenic gene combinations (L2, L3 and L4, expressing Zmpsy1; Zmpsy1; PacrtI; ParacrtW; and Zmpsy1; ParacrtW and Gllycb, respectively). In transgenic lines with a high carotenoid content total starch content was lower by approximately 8%. I established that this effect was not due to downregulation of starch-related biosynthetic genes, which suggests that reduction in starch levels might be due to an alternative mechanism. A transgenic line (HC) overexpressing Zmpsy1 and PacrtI was crossed with different inbred lines belonging to well-known heterotic groups in order to obtain high-yielding hybrids accumulating carotenoids. I assessed the performance of the hybrids (agronomic and ear morphologic traits) in two different environments in one growing season. Results indicated that field performance of high carotenoid maize hybrids was similar or on occasion superior to commercial hybrids commonly grown in the area.Mi programa de investigación se ha centrado en el estudio de los mecanismos de acumulación de carotenoides en maíz (Zea mays). Inicialmente, cloné de la variedad de maíz B73 un gen candidato para la enzima ε-hidroxilasa de carotenoides (CYP97C19). Basándome en los resultados del perfil metabólico de la ruta de los carotenoides en líneas transgénicas del mutante de Arabidopsislut1 (carente de luteína) que sobre expresaban CYP97C de maíz (la acumulación de luteína en las líneas transgénicas se producía a expensas de una reducción de zeinoxantina), concluí que el gen CYP97C19 de maíz era una ε-hidroxilasa de carotenoides funcional. En un experimento independiente, caractericé dos líneas transgénicas de maíz que sobreexpresaban el gen Orange de Arabidopsis (AtOR). Las dos líneas mostraron un incremento del contenido de carotenoides sin variar la expresión de genes carotenogénicos endógenos. Posteriormente, crucé la línea que acumulaba más carotenoides con líneas transgénicas con perfiles de carotenoides distintos. En los casos en que el parental transgénico acumulaba pocos carotenoides, el híbrido resultante mostró un incremento sustancial del contenido de carotenoides sin cambios aparentes en la composición de éstos. En cambio, ningún efecto se observó en los niveles metabólicos y transcriptómicos de los híbridos cuando el contenido de carotenoides de los parentales era elevado. Los resultados de estos experimentos indican que una de las funciones del gen Orange de Arabidopsis en endospermo de maíz es generar un sumidero metabólico para la acumulación de carotenoides. Paralelamente, realicé un experimento en el que se silenciaron las enzimas β-hidroxilasa de carotenoides, la BCH1 y la BCH2, mediante RNAi en cultivares de maíz que acumulan elevadas cantidades de luteína y zeaxantina. Los resultados me permitieron concluir que estas dos enzimas son clave para la determinación del contenido de β-caroteno y zexantina en maíz. También analicé la interacción entre la ruta metabólica de los carotenoides y la del almidón ya que comparten precursores comunes. El análisis del contenido total de almidón en cuatro líneas transgénicas (L1: sobreexpresión de AtOR; L2, sobreexpresión de Zmpsy1; L3, sobreexpresión de Zmpsy1, PacrtIy ParacrtW; L4, sobreexpresión de Zmpsy1, PacrtI y Gllycb) demostró que se producía una disminución de hasta el 8%. Por lo que deduje que este efecto no se debía a la reducción de la capacidad biosintética de formación de almidón, por lo que propuse que la reducción de los niveles de almidón se debía a un mecanismo alternativo. Finalmente, crucé una línea transgénica (HC) que sobreexpresaba Zmpsy1 y PacrtI con diferentes líneas puras pertenecientes a grupos heteróticos conocidos para obtener híbridos de maíz de alta producción y acumulación de carotenoides. Evalué el desarrollo de los híbridos (caracteres agronómicos y morfológicos) en dos ambientes distintos durante una estación de cultivo. Los resultados indicaron que el comportamiento en campo de los híbridos con alto contenido de carotenoides fue similar y en ocasiones superior a los híbridos comerciales que se cultivan en la zona.El programa de recerca que he desenvolupat s’ha centrat en l’estudi dels mecanismes d’acumulació de carotenoides en blat de moro (Zea mays). Inicialment, vaig clonar de la varietat de blat de moro B73 un gen candidat a ε-hidroxilasa de la ruta biocinètica dels carotenoides (CYP97C19). En base als resultats obtinguts en línies transgèniques derivades del mutant d’Arabidopsis lut1 (mancat de luteïna) en les quals es va sobreexpressar el gen CYP9719 de blat de moro, que confirmaven l’acumulació de luteïna a expenses de zeinoxantina, vaig concloure que CYP97C19 és una ε-hidroxilasa de carotenoides funcional. En un segon experiment, vaig generar i caracteritzar dues línies transgèniques de blat de moro que sobreexpressaven el gen Orange d’Arabidopsis (AtOR). Les dues línies mostraren un increment en el contingut de carotenoides sense augmentar l’expressió de gens carotenogènics endògens. Posteriorment vaig creuar la línia que acumulava més carotenoides amb línies transgèniques que presentaven perfils de carotenoides diferents. En els casos en què el parental transgènic original creuat amb AtOR tenia poca concentració de carotenoides, l’híbrid resultant va mostrar un increment substancial del contingut de carotenoides, sense canvis aparents en la composició d’aquests. En canvi, quan el contingut de carotenoides dels parentals era elevat, no es van observar canvis a nivell del metaboloma i transcriptoma en els híbrids. Els resultats d’aquests experiments suggereixen que una de les funcions del gen Orange d’Arabidopsis en l’endosperma de blat de moro és generar un depòsit metabòlic per a carotenoides. Paral•lelament, vaig realitzar un experiment en el que vaig silenciar els enzims β-hidroxilasa de carotenoides, el BCH1 i el BCH2, a través de RNAi en diferents cultivars de blat de moro que acumulaven elevades quantitats de luteïna i zeaxantina. Els resultats que vaig obtenir em van permetre concloure que aquestes dos enzims eren clau per a modular el contingut de β-carotè en blat de moro. També vaig investigar la interacció entre la ruta metabòlica dels carotenoides i la del midó, ja que comparteixen precursors comuns. L’anàlisi del contingut total de midó en quatre línies transgèniques (L1: sobreexpressió de AtOR; L2, sobreexpressió de Zmpsy1; L3, sobreexpressió de Zmpsy1, PacrtIi ParacrtW; L4, sobreexpressió de Zmpsy1, PacrtIi Gllycb) va mostrar fins a una disminució del 8%. A més, vaig establir que aquest efecte no era degut a la reducció de la capacitat biosintètica per formar midó; per la qual cosa vaig suggerir que la reducció dels nivells de midó es devien a un mecanisme alternatiu. Finalment, vaig creuar una línia transgènica (HC) que sobreexpressaZmpsy1 i PacrtI amb diferents línies pures representants de grups heteròtics coneguts per tal d’obtenir híbrids de blat de moro d’altra producció i acumulació de carotenoides. Vaig avaluar el desenvolupament dels híbrids (caràcters agronòmics i morfològics) en dos ambients diferents durant una estació de cultiu. Els resultats indicaren que el comportament en el camp dels híbrids amb alt contingut de carotenoides era semblant, i en ocasions superior, als híbrids comercials que es cultiven a la zona

Unravelling the molecular bases of carotenoid biosynthesis in maize

My research program focused on the elucidation of the mechanisms of carotenoid accumulation in maize (Zea mays). I amplified a putative carotenoid ε-hydroxylase, named CYP97C19, from the yellow maize variety B73. Metabolic profiling of the carotenoid pathway in Arabidopsis lut1 mutant (lacking lutein) overexpressing maize CYP97C19 confirmed the accumulation of lutein in transgenic lines at the expense of zeinoxanthin. This allowed me to conclude that maize CY P97C19 is a functional ε-hydroxylase. In a separate experiment, I characterized two transgenic lines overexpressing the Arabidopsis Orange gene (AtOR). Both lines exhibited an increase in carotenoid content without any concomitant upregulation of endogenous carotenogenic gene expression. The highest carotenoid accumulating line was crossed with different transgenic lines with diverse carotenoid profiles. In cases in which the original transgenic parent that was crossed with the AtOr line accumulated low levels of total carotenoids, resulting hybrids exhibited a substantial increase of total carotenoid content without any changes in the qualitative carotenoid composition. No changes at the metabolite and transcript profiles were observed in the hybrids when the carotenoid content in the original parents used to cross with the AtOr line was high. Results from these experiments suggest that one of the functions of the Orange gene in maize endosperm is to generate a metabolic sink for carotenoids. Results from experiments in which carotenoid β-hydroxylase (BCH1 and BCH2) was silenced in genotypes able to accumulate high lutein and high zeaxanthin levels indicated that these genes are determinans of β-carotene and zeaxanthin accumulation. I also investigated the interactions between the carotenoid and starch biosynthetic pathways as they share common precursors. I analyzed total starch content in four transgenic maize lines: one line overexpressing AtOR (L1) and three lines expressing different carotenogenic gene combinations (L2, L3 and L4, expressing Zmpsy1; Zmpsy1; PacrtI; ParacrtW; and Zmpsy1; ParacrtW and Gllycb, respectively). In transgenic lines with a high carotenoid content total starch content was lower by approximately 8%. I established that this effect was not due to downregulation of starch-related biosynthetic genes, which suggests that reduction in starch levels might be due to an alternative mechanism. A transgenic line (HC) overexpressing Zmpsy1 and PacrtI was crossed with different inbred lines belonging to well-known heterotic groups in order to obtain high-yielding hybrids accumulating carotenoids. I assessed the performance of the hybrids (agronomic and ear morphologic traits) in two different environments in one growing season. Results indicated that field performance of high carotenoid maize hybrids was similar or on occasion superior to commercial hybrids commonly grown in the area.Mi programa de investigación se ha centrado en el estudio de los mecanismos de acumulación de carotenoides en maíz (Zea mays). Inicialmente, cloné de la variedad de maíz B73 un gen candidato para la enzima ε-hidroxilasa de carotenoides (CYP97C19). Basándome en los resultados del perfil metabólico de la ruta de los carotenoides en líneas transgénicas del mutante de Arabidopsislut1 (carente de luteína) que sobre expresaban CYP97C de maíz (la acumulación de luteína en las líneas transgénicas se producía a expensas de una reducción de zeinoxantina), concluí que el gen CYP97C19 de maíz era una ε-hidroxilasa de carotenoides funcional. En un experimento independiente, caractericé dos líneas transgénicas de maíz que sobreexpresaban el gen Orange de Arabidopsis (AtOR). Las dos líneas mostraron un incremento del contenido de carotenoides sin variar la expresión de genes carotenogénicos endógenos. Posteriormente, crucé la línea que acumulaba más carotenoides con líneas transgénicas con perfiles de carotenoides distintos. En los casos en que el parental transgénico acumulaba pocos carotenoides, el híbrido resultante mostró un incremento sustancial del contenido de carotenoides sin cambios aparentes en la composición de éstos. En cambio, ningún efecto se observó en los niveles metabólicos y transcriptómicos de los híbridos cuando el contenido de carotenoides de los parentales era elevado. Los resultados de estos experimentos indican que una de las funciones del gen Orange de Arabidopsis en endospermo de maíz es generar un sumidero metabólico para la acumulación de carotenoides. Paralelamente, realicé un experimento en el que se silenciaron las enzimas β-hidroxilasa de carotenoides, la BCH1 y la BCH2, mediante RNAi en cultivares de maíz que acumulan elevadas cantidades de luteína y zeaxantina. Los resultados me permitieron concluir que estas dos enzimas son clave para la determinación del contenido de β-caroteno y zexantina en maíz. También analicé la interacción entre la ruta metabólica de los carotenoides y la del almidón ya que comparten precursores comunes. El análisis del contenido total de almidón en cuatro líneas transgénicas (L1: sobreexpresión de AtOR; L2, sobreexpresión de Zmpsy1; L3, sobreexpresión de Zmpsy1, PacrtIy ParacrtW; L4, sobreexpresión de Zmpsy1, PacrtI y Gllycb) demostró que se producía una disminución de hasta el 8%. Por lo que deduje que este efecto no se debía a la reducción de la capacidad biosintética de formación de almidón, por lo que propuse que la reducción de los niveles de almidón se debía a un mecanismo alternativo. Finalmente, crucé una línea transgénica (HC) que sobreexpresaba Zmpsy1 y PacrtI con diferentes líneas puras pertenecientes a grupos heteróticos conocidos para obtener híbridos de maíz de alta producción y acumulación de carotenoides. Evalué el desarrollo de los híbridos (caracteres agronómicos y morfológicos) en dos ambientes distintos durante una estación de cultivo. Los resultados indicaron que el comportamiento en campo de los híbridos con alto contenido de carotenoides fue similar y en ocasiones superior a los híbridos comerciales que se cultivan en la zona.El programa de recerca que he desenvolupat s’ha centrat en l’estudi dels mecanismes d’acumulació de carotenoides en blat de moro (Zea mays). Inicialment, vaig clonar de la varietat de blat de moro B73 un gen candidat a ε-hidroxilasa de la ruta biocinètica dels carotenoides (CYP97C19). En base als resultats obtinguts en línies transgèniques derivades del mutant d’Arabidopsis lut1 (mancat de luteïna) en les quals es va sobreexpressar el gen CYP9719 de blat de moro, que confirmaven l’acumulació de luteïna a expenses de zeinoxantina, vaig concloure que CYP97C19 és una ε-hidroxilasa de carotenoides funcional. En un segon experiment, vaig generar i caracteritzar dues línies transgèniques de blat de moro que sobreexpressaven el gen Orange d’Arabidopsis (AtOR). Les dues línies mostraren un increment en el contingut de carotenoides sense augmentar l’expressió de gens carotenogènics endògens. Posteriorment vaig creuar la línia que acumulava més carotenoides amb línies transgèniques que presentaven perfils de carotenoides diferents. En els casos en què el parental transgènic original creuat amb AtOR tenia poca concentració de carotenoides, l’híbrid resultant va mostrar un increment substancial del contingut de carotenoides, sense canvis aparents en la composició d’aquests. En canvi, quan el contingut de carotenoides dels parentals era elevat, no es van observar canvis a nivell del metaboloma i transcriptoma en els híbrids. Els resultats d’aquests experiments suggereixen que una de les funcions del gen Orange d’Arabidopsis en l’endosperma de blat de moro és generar un depòsit metabòlic per a carotenoides. Paral•lelament, vaig realitzar un experiment en el que vaig silenciar els enzims β-hidroxilasa de carotenoides, el BCH1 i el BCH2, a través de RNAi en diferents cultivars de blat de moro que acumulaven elevades quantitats de luteïna i zeaxantina. Els resultats que vaig obtenir em van permetre concloure que aquestes dos enzims eren clau per a modular el contingut de β-carotè en blat de moro. També vaig investigar la interacció entre la ruta metabòlica dels carotenoides i la del midó, ja que comparteixen precursors comuns. L’anàlisi del contingut total de midó en quatre línies transgèniques (L1: sobreexpressió de AtOR; L2, sobreexpressió de Zmpsy1; L3, sobreexpressió de Zmpsy1, PacrtIi ParacrtW; L4, sobreexpressió de Zmpsy1, PacrtIi Gllycb) va mostrar fins a una disminució del 8%. A més, vaig establir que aquest efecte no era degut a la reducció de la capacitat biosintètica per formar midó; per la qual cosa vaig suggerir que la reducció dels nivells de midó es devien a un mecanisme alternatiu. Finalment, vaig creuar una línia transgènica (HC) que sobreexpressaZmpsy1 i PacrtI amb diferents línies pures representants de grups heteròtics coneguts per tal d’obtenir híbrids de blat de moro d’altra producció i acumulació de carotenoides. Vaig avaluar el desenvolupament dels híbrids (caràcters agronòmics i morfològics) en dos ambients diferents durant una estació de cultiu. Els resultats indicaren que el comportament en el camp dels híbrids amb alt contingut de carotenoides era semblant, i en ocasions superior, als híbrids comercials que es cultiven a la zona

The silencing of carotenoid β-hydroxylases by RNA interference in different maize genetic backgrounds increases the β-carotene content of the endosperm

Maize (Zea mays L.) is a staple food in many parts of Africa, but the endosperm generally contains low levels of the pro-vitamin A carotenoid -carotene, leading to vitamin A deficiency disease in populations relying on cereal-based diets. However, maize endosperm does accumulate high levels of other carotenoids, including zeaxanthin, which is derived from -carotene via two hydroxylation reactions. Blocking these reactions could therefore improve the endosperm -carotene content. Accordingly, we used RNA interference (RNAi) to silence the endogenous ZmBCH1 and ZmBCH2 genes, which encode two non-heme di-iron carotenoid -hydroxylases. The genes were silenced in a range of maize genetic backgrounds by introgressing the RNAi cassette, allowing us to determine the impact of ZmBCH1/ZmBCH2 silencing in diverse hybrids. The -carotene content of the endosperm increased substantially in all hybrids in which ZmBCH2 was silenced, regardless of whether or not ZmBCH1 was silenced simultaneously. However, the -carotene content did not change significantly in C17 hybrids (M7 C17 and M13 C17) compared to C17 alone, because ZmBCH2 is already expressed at negligible levels in the C17 parent. Our data indicate that ZmBCH2 is primarily responsible for the conversion of -carotene to zeaxanthin in maize endosper

Cloning and Functional Characterization of the Maize (Zea mays L.) Carotenoid Epsilon Hydroxylase Gene

The assignment of functions to genes in the carotenoid biosynthesis pathway is necessary to understand how the pathway is regulated and to obtain the basic information required for metabolic engineering. Few carotenoid ε-hydroxylases have been functionally characterized in plants although this would provide insight into the hydroxylation steps in the pathway. We therefore isolated mRNA from the endosperm of maize (Zea mays L., inbred line B73) and cloned a full-length cDNA encoding CYP97C19, a putative heme-containing carotenoid ε hydroxylase and member of the cytochrome P450 family. The corresponding CYP97C19 genomic locus on chromosome 1 was found to comprise a single-copy gene with nine introns. We expressed CYP97C19 cDNA under the control of the constitutive CaMV 35S promoter in the Arabidopsis thaliana lut1 knockout mutant, which lacks a functional CYP97C1 (LUT1) gene. The analysis of carotenoid levels and composition showed that lutein accumulated to high levels in the rosette leaves of the transgenic lines but not in the untransformed lut1 mutants. These results allowed the unambiguous functional annotation of maize CYP97C19 as an enzyme with strong zeinoxanthin ε-ring hydroxylation activity