Cystein-Mutanten der Cu,Zn-Superoxiddismutase und ihre Anwendung in Proteinelektroden für die Detektion von freien Sauerstoffradikalen

Das Enzym Superoxiddismutase (SOD) bietet wegen seiner hohen Reaktionsrate und seiner extrem hohen Substratspezifi tät große Vorteile für eine Anwendung als Superoxidbiosensor. In dieser Arbeit wurden durch molekularbiologische Methoden Mutanten der humanen Cu,Zn-SOD gewonnen, welche ein oder zwei zusätzliche Cystein-Reste enthielten, die eine einfache Immobilisierung des Proteins durch Bindung des Cystein-Schwefels auf Goldelektroden ermöglichten. Sechs solcher Mutanten wurden entworfen, exprimiert, aufgereinigt und elektrochemisch charakterisiert. Alle Mutanten konnten durch einen einfachen Inkubationsschritt auf Goldelektroden gebunden werden und zeigten ein quasi-reversibles elektrochemisches Ansprechen. Für eine Mutante wurde die Anwendung als Superoxidsensor genauer untersucht und für beide Teilreaktionen der Dismutation ein Ansprechen des Sensors auf das Radikal gefunden. Bei Verwendung einer Teilreaktion konnte die Empfindlichkeit herkömmlicher Monoschichtsensoren um etwa eine Größenordnung übertroffen werden

Sensitive fluorescence detection of nucleic acids based on isothermal circular strand-displacement polymerization reaction

Here we have developed a sensitive DNA amplified detection method based on isothermal strand-displacement polymerization reaction. This method takes advantage of both the hybridization property of DNA and the strand-displacement property of polymerase. Importantly, we demonstrate that our method produces a circular polymerization reaction activated by the target, which essentially allows it to self-detect. Functionally, this DNA system consists of a hairpin fluorescence probe, a short primer and polymerase. Upon recognition and hybridization with the target ssDNA, the stem of the hairpin probe is opened, after which the opened probe anneals with the primer and triggers the polymerization reaction. During this process of the polymerization reaction, a complementary DNA is synthesized and the hybridized target is displaced. Finally, the displaced target recognizes and hybridizes with another probe, triggering the next round of polymerization reaction, reaching a target detection limit of 6.4 × 10−15 M

Cytochrom c-basierter Superoxidsensor in organischen Medien

Das Superoxid-Radikal O2- ist wegen seiner toxischen Wirkung in der Medizin von grossem Interesse. Es hat sich ausserdem als geeignetes Modellsystem zur Untersuchung von Radikal-Scavengern bewährt. Der untersuchte Sensor besteht aus an einer Goldelektrode kovalent immobilisiertem Cytochrom c und kann amperometrisch zur Bestimmung der Konzentration von Superoxid-Radikalen verwendet werden. Dies ermöglicht, die antioxidative Wirkung von Substanzen nachzuweisen, welche Superoxid-Ionen abfangen und somit die Superoxid-Konzentration im Medium verringern. Die Methode ist in rein wässrigen Systemen etabliert. Dies limitiert allerdings die Anwendung auf hydrophile Substanzen. Der Sensor kann somit nicht für die Charakterisierung der Vielzahl von antioxidativ wirksamen hydrophoben Naturprodukten, wie etwa Vitaminen, und der Bestimmung der Effektivität von kosmetischen Produkten auf Creme-Basis mit verschiedenen antioxidativen Beigaben angewendet werden. Insbesondere die Bestimmung der Gesamt-Effektivität von kosmetischen Produkten mit verschiedenen antioxidativen Zusätzen ist hier von grossem Interesse. Um diese Beschränkung aufzuheben und somit die Anwendungsbreite des Sensors erheblich zu erweitern, werden in der vorliegenden Arbeit die Elektrochemie von kovalent immobilisiertem Cytochrom c und das Detektionsverhalten des Sensors in nicht rein wässrigen Lösungen, d.h. in verschiedenen organischen Lösungsmitteln sowie Gemischen dieser Lösungsmittel mit wässrigem Puffer, untersucht. Im etablierten Sensor wird das Cytochrom c mittels des Linkers Mercaptoundecansäure kovalent an einer Goldelektrode immobilisiert. Dessen Schwefel-Gruppe bindet an die Oberfläche der Goldelektrode; die Säurefunktion wird an Lysin-Reste des Cytochrom c kovalent gebunden

Electrochemistry of nanozeolite-immobilized cytochrome c in aqueous and nonaqueous solutions

peer-reviewedThe electrochemical properties of cytochrome c (cyt c) immobilized on multilayer nanozeolite-modified electrodes have been examined in aqueous and nonaqueous solutions. Layers of Linde type-L zeolites were assembled on indium tin oxide (ITO) glass electrodes followed by the adsorption of cyt c, primarily via electrostatic interactions, onto modified ITO electrodes. The heme protein displayed a quasi-reversible response in aqueous solution with a redox potential of +324 mV (vs NHE), and the surface coverage (Gamma*) increased linearly for the first four layers and then gave a nearly constant value of 200 pmol cm(-2). On immersion of the modified electrodes in 95% (v/v) nonaqueous solutions, the redox potential decreased significantly, a decrease that originated from changes in both the enthalpy and entropy of reduction. On reimmersion of the modified electrode in buffer, the faradic response immediately returned to its original value. These results demonstrate that nanozeolites are potential stable supports for redox proteins and enzymes.ACCEPTEDpeer-reviewe