Do hypoxia/normoxia culturing conditions change the neuroregulatory profile of Wharton Jelly mesenchymal stem cells secretome?

Introduction: The use of human umbilical cord Wharton Jelly-derived mesenchymal stem cells (hWJ-MSCs) has been considered a new potential source for future safe applications in regenerative medicine. Indeed, the application of hWJ-MSCs into different animal models of disease, including those from the central nervous system, has shown remarkable therapeutic benefits mostly associated with their secretome. Conventionally, hWJ-MSCs are cultured and characterized under normoxic conditions (21 % oxygen tension), although the oxygen levels within tissues are typically much lower (hypoxic) than these standard culture conditions. Therefore, oxygen tension represents an important environmental factor that may affect the performance of mesenchymal stem cells in vivo. However, the impact of hypoxic conditions on distinct mesenchymal stem cell characteristics, such as the secretome, still remains unclear. Methods: In the present study, we have examined the effects of normoxic (21 % O2) and hypoxic (5 % O2) conditions on the hWJ-MSC secretome. Subsequently, we address the impact of the distinct secretome in the neuronal cell survival and differentiation of human neural progenitor cells. Results: The present data indicate that the hWJ-MSC secretome collected from normoxic and hypoxic conditions displayed similar effects in supporting neuronal differentiation of human neural progenitor cells in vitro. However, proteomic analysis revealed that the use of hypoxic preconditioning led to the upregulation of several proteins within the hWJ-MSC secretome. Conclusions: Our results suggest that the optimization of parameters such as hypoxia may lead to the development of strategies that enhance the therapeutic effects of the secretome for future regenerative medicine studies and applications. © 2015 Teixeira et al.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) (Ciência 2007 program and IF Development Grant (AJS); and pre-doctoral fellowships to FGT (SFRH/69637/ 2010) and SIA (SFRH/BD/81495/2011); Canada Research Chairs (LAB) and a SSE Postdoctoral Fellowship (KMP); The National Mass Spectrometry Network (RNEM) (REDE/1506/REM/2005); co-funded by Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), ao abrigo do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Χαρακτηρισμός των αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων του μυελού των οστών σε ασθενείς με μυελικές διαταραχές χρησιμοποιώντας χρωμοσωμική ανάλυση και τεχνικές μοριακής γενετικής

Στο μυελό των οστών βρίσκονται τουλάχιστον δύο τύποι αρχέγονων πολυδύναμων κυττάρων: τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (ΗSCs) και τα αρχέγονα μεσεγχυματικά κύτταρα (ΜSCs). Αν και παραδοσιακά οι δύο αυτοί τύποι κυττάρων θεωρούνται ξεχωριστοί ως προς την προέλευση και τη δυνατότητα διαφοροποίησης, υπάρχουν ωστόσο ορισμένες έμμεσες ενδείξεις που υποστηρίζουν ότι τα HSCs και MSCs μπορούν να έλκουν την καταγωγή τους από κοινό πρόγονο. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του κατά πόσο ο παθολογικός κλώνος σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML), μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (MDS) ή μυελοϋπερπλαστικά σύνδρομα (MPD) αφορά στο προαναφερθέντα κοινό πρόγονο των HSCs και MSCs. Προκειμένου να απαντηθεί το ερώτημα αυτό εκτιμήθηκε αν οι σχετιζόμενες με την μυελική κακοήθεια μεταλλάξεις και χρωμοσωμικές ανωμαλίες που ανιχνεύονται στα αιμοποιητικά κύτταρα των ασθενών απαντώνται επίσης στα MSCs αυτών. Μελετήθηκαν 16 ασθενείς με MDS, 12 με AML και 7 με MPD, καθώς 10 υγιή άτομα αναλόγου ηλικίας και φύλου ως μάρτυρες. Απομονώθηκε DNA και RNA από το κλάσμα των μυελικών μονοπύρηνων κυττάρων και από καλλιεργηθέντα μυελικά MSCs. Με PCR σε γενωμικό DNA ελέγχθηκε η παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο FLT3 και με RT-PCR οι μεταλλάξεις στο γονίδιο NPM1 σε πάσχοντες με MDS και AML. Η παρουσία της μετάλλαξης V617F/G1849T στο γονίδιο JAK2 στους πάσχοντες με MPD ελέγχθηκε με real time RT-PCR. Επιπλέον τα μεσεγχυματικά και τα αιμοποιητικά κύτταρα που συμπεριλήφθησαν στη μελέτη υποβλήθηκαν σε κυτταρογενετική ανάλυση. Στο σύνολο των ασθενών με MDS και AΜL, ανιχνεύθηκαν δυο πάσχοντες από ΑΜL που έφεραν μεταλλάξεις στα μυελικά μονοπύρηνα κύτταρα: ο ένας έφερε μετάλλαξη στο γονίδιο NPM1 και ο άλλος στα γονίδια FLT3 και NPM1. Τέσσερις πάσχοντες με MPD έφεραν τη μετάλλαξη V617F του γονιδίου JAK2 στα μυελικά μονοπύρηνα κύτταρα. Εις ό,τι αφορά στα MSCs, σε κανέναν από τους 35 ασθενείς της μελέτης δεν ανιχνεύθηκε κάποια από τις ανωτέρω μεταλλάξεις. Επιπλέον, κανείς από τους μάρτυρες δεν έφερε μεταλλάξεις στα μυελικά μονοπύρηνα κύτταρα ή στα ΜSCs. 6/28 ασθενείς με MDS ή AML παρουσίασαν χρωμοσωμικές ανωμαλίες στα αιμοποιητικά κύτταρα, και 1/28 και στα MSCs. Τέλος δύο από τα υγιή άτομα έφεραν χρωμοσωμικές ανωμαλίες στα ΜSCs, ενώ τα αντίστοιχα ΗSCs ήταν υγιή. Αυτή η μελέτη ενισχύει την άποψη πως τα MSCs δεν φαίνεται να συμμετέχουν στον κακοήθη 7 κλώνο που εντοπίζεται στις αιματολογικές διαταραχές όπως είναι οι AML, MDS και MPD.In bone marrow (BM) there are at least two types of multipotent stem cells: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs). Although in general these two cell types are distinct as regards their origin and differentiation potential, there are some indirect evidence supporting that HSCs and MSCs may have their origin from a common ancestor stem cell. The aim of this study is to investigate whether the abnormal clone in acute myeloid leukemia (AML) -, myelodysplastic syndromes (MDS) - or myeloproliferative syndromes (MPD) – patients, derives from the aforementioned common ancestor stem cell of HSCs and MSCs. To answer this question we assessed whether the associated with myeloid malignancy mutations and chromosomal aberrations detected in hematopoietic cells of patients, were also found in patient MSCs. We studied 16 MDS patients, 12 AML and 7 MPD, and 10 healthy age- and sex-matched individuals. DNA and RNA were isolated from the mononuclear myeloid cell fraction and cultured marrow MSCs. The presence of mutations in FLT3 gene was evaluated by genomic DNA PCR and the presence of mutations in the NPM1 gene in patients with MDS and AML was assessed by RT-PCR. The presence of mutation V617F/G1849T in JAK2 gene was detected by real time RT-PCR in patients with MPD. Moreover, MSCs and hematopoietic cells were subjected into cytogenetic analysis. In the total of MDS and AML patients, two AML patients were identified with gene mutations in bone marrow mononuclear cells: one harbored mutations in FLT3 and NPM1 genes and the other harbored a mutation in NPM1 gene. Four MPD patients were positive for the JAK2 mutation in bone marrow mononuclear cells. In respect to MSCs, none of the 35 patients harbored any of these mutations. Furthermore none of the healthy individuals harbored mutations in marrow mononuclear cells or MSCs. In 6/28 of MDS or AML patients, chromosomal abnormalities were identified in HSCs, and 1/28 in corresponding MSCs. Finally, two of healthy subjects were identified with chromosomal abnormalities in MSCs, but the corresponding HSCs were normal. In view of these data, this study gives further confirm to the absence of clonal involvement of MSCs in hematological malignancies, especially in AML, MDS and MPD

Compartive study of umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly with bone marrow mesenchymal stem cells

In view of the current interest in exploring the clinical use of mesenchymal stem cells(MSCs) from different sources, we performed a side-by-side comparison of thebiological properties of MSCs isolated from the Wharton’s jelly (WJ), the mostabundant MSC source in umbilical cord, with bone marrow (BM)-MSCs, the mostextensively studied MSC population. MSCs were isolated and expanded from BMaspirates of hematologically healthy donors (n = 18) and from the WJ of full-termneonates (n = 18). We evaluated, in parallel experiments, the MSC immunophenotypic,survival and senescence characteristics as well as their proliferative potential and cellcycle distribution. We also assessed the expression of genes associated with the Wntandcell cycle-signaling pathway and we performed karyotypic analysis throughpassages to evaluate the MSC genomic stability. The hematopoiesis-supportingcapacity of MSCs from both sources was investigated by evaluating the clonogeniccells in the non-adherent fraction of MSC co-cultures with BM or umbilical cord bloodderivedCD34+ cells and by measuring the hematopoietic cytokines levels in MSCculture supernatants. Finally, we evaluated the ability of MSCs to differentiate intoadipocytes and osteocytes and the effect of the WNT-associated molecules WISP1and sFRP4 on the differentiation potential of WJ-MSCs. Both ex vivo-expanded MSCpopulations showed similar morphologic, immunophenotypic, survival and senescencecharacteristics and acquired genomic alterations at low frequency during passages.WJ-MSCs exhibited higher proliferative potential, possibly due to upregulation ofgenes that stimulate cell proliferation along with downregulation of genes related tocell cycle inhibition. WJ-MSCs displayed inferior lineage priming and differentiationcapacity toward osteocytes and adipocytes, compared to BM-MSCs. This finding wasassociated with differential expression of molecules related to Wnt signaling, includingWISP1 and sFRP4, the respective role of which in the differentiation potential of WJMSCswas specifically investigated. Interestingly, treatment of WJ-MSCs withrecombinant human WISP1 or sFRP4 resulted in induction of osteogenesis andadipogenesis, respectively. WJ-MSCs exhibited inferior hematopoiesis-supportingpotential probably due to reduced production of stromal cell-Derived Factor-1α,compared to BM-MSCs. Overall, these data are anticipated to contribute to the bettercharacterization of WJ-MSCs and BM-MSCs for potential clinical applications.Συνεχώς αυξανόμενο είναι το ενδιαφέρον για τη χρήση των αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων (Mesenchymal Stem/Stromal Cells–MSCs) σε κλινικές εφαρμογές. Το ενδεχόμενο MSCs από ποικίλες πηγές να ικανοποιούν διαφορετικές κλινικές εφαρμογές μας ώθησε στην παρούσα μελέτη. Έτσι πραγματοποίησαμε μια συγκριτική μελέτη των βιολογικών ιδιοτήτων MSCs προερχόμενων από τη γέλη του Wharton (Wharton’s Jelly–WJ), την πιο πλούσια πηγή MSCs του ομφαλίου λώρου, και MSCs από τον μυελό των οστών (Bone Marrow–BM), του πιο εκτενώς μελετημένου πληθυσμού μεσεγχυματικών κυττάρων.Στη διάρκεια της μελέτης, MSCs απομονώθηκαν από τον μυελό αιματολογικά υγιών δοτών (n=18) και από τη γέλη του Wharton νεογνών πλήρους κυήσεως (n=18).Τα MSCs καλλιεργήθηκαν ex vivo για συνολικά δέκα ανακαλλιέργειες (Passage–P)υπό τις ίδιες συνθήκες. Σε παράλληλα πειράματα μελετήθηκαν τα ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά των κυττάρων καθώς και χαρακτηριστικά που αφορούν την επιβίωση και την κυτταρική γήρανση όπως το δυναμικό πολλαπλασιασμού και η κατανομή τούς στον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον εκτιμήθηκε η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τα σηματοδοτικά μονοπάτια του Wnt και του κυτταρικού κύκλου, ενώ πραγματοποιήθηκε και κυτταρογενετική ανάλυση των ex vivo καλλιεργούμενων MSCs ώστε να εκτιμηθεί η γενωμική τούς σταθερότητα.Επιπροσθέτως, μελετήθηκε η ικανότητα των MSCs, και από τις δύο πηγές, να υποστηρίζουν την ανάπτυξη αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, εκτιμώντας τη κλωνογονική ικανότητα των μη-προσκολλούμενων κυττάρων (Non Adherent Cells–NACs) σε συν‐καλλιέργειες φυσιολογικών CD34+ κυττάρων, με BM-MSCs ή WJMSCs.Επίσης μετρήθηκαν τα επίπεδα κυτταροκινών που σχετίζονται με την αιμοποίηση στα υπερκείμενα των MSC καλλιεργειών. Τέλος, εκτιμήθηκε η ικανότητα διαφοροποίησης των MSCs προς λιποκύτταρα και οστεοκύτταρα καθώς και η επίδραση των σχετιζόμενων με το Wnt-μονοπάτι μορίων WISP1 και sFRP4 στο δυναμικό διαφοροποίησης των WJ- MSCs.Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων φάνηκε πως και οι δυο exvivo καλλιεργούμενοι MSC πληθυσμοί (BM-MSCs ή WJ-MSCs) εμφανίζουν παρόμοια μορφολογικά και ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Επιπλέον δεν διέφεραν ως προς χαρακτηριστικά επιβίωσης και κυτταρικής γήρανσης, ενώ φάνηκε να φέρουν γενετικές αλλαγές σε πολύ χαμηλή συχνότητα στη διάρκεια των ανακαλλιεργειών. Τα WJ-MSCsεμφάνισαν υψηλότερο δυναμικό πολλαπλασιασμού, πιθανότατα λόγω ενεργοποίησης γονιδίων που διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ταυτόχρονης υποέκφρασης γονιδίων που αναστέλλουν τον κυτταρικό κύκλο. Ωστόσο, τα WJMSCsπαρουσίασαν μειωμένη ενδογενή δέσμευση προς κάποια σειρά (lineagepriming)καθώς και μειωμένη ικανότητα διαφοροποίησης προς οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα, συγκριτικά με τα BM-MSCs. Το παραπάνω εύρημα συσχετίστηκε με τη διαφορετική έκφραση μορίων που σχετίζονται με το Wnt-σηματοδοτικό μονοπάτι,περιλαμβανομένων των WISP1 και sFRP4, και διερευνήθηκε αντιστοίχως η εμπλοκήτου καθενός μορίου στη διαφοροποίηση των WJ-MSCs. Μάλιστα χορήγηση των ανασυνδιασμένων ανθρώπινων πρωτεϊνών WISP1 και sFRP4 στα καλλιεργούμενα WJ-MSCs οδήγησε σε επαγωγή και βελτίωση της οστεογενετικής και λιπογενετικής ικανότητας των κυττάρων, αντιστοίχως. Τέλος, τα WJ-MSCs εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα να υποστηρίζουν την αιμοποίηση σε σχέση με τα ομολογά τους μυελικά, πιθανότατα εξαιτίας της μειωμένης παραγωγής του παράγοντα του«στρώματος» SDF-1α (stromal cell-derived factor-1α).Συμπερασματικά τα μέχρι στιγμής δεδομένα συμβάλλουν στον καλύτερο χαρακτηρισμό των WJ-MSCs και των BM-MSCs αναδεικνύοντας τις ιδιαίτερες βιολογικές τους ιδιότητες, που θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψιν κατά την επιλογή της καλύτερης πηγής MSCs για καθεμιά κλινική εφαρμογή

Therapeutic Implications of Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles in Autoimmune Diseases: From Biology to Clinical Applications

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are perivascular multipotent stem cells originally identified in the bone marrow (BM) stroma and subsequently in virtually all vascularized tissues. Because of their ability to differentiate into various mesodermal lineages, their trophic properties, homing capacity, and immunomodulatory functions, MSCs have emerged as attractive candidates in tissue repair and treatment of autoimmune disorders. Accumulating evidence suggests that the beneficial effects of MSCs may be primarily mediated via a number of paracrine-acting soluble factors and extracellular vesicles (EVs). EVs are membrane-coated vesicles that are increasingly being acknowledged as playing a key role in intercellular communication via their capacity to carry and deliver their cargo, consisting of proteins, nucleic acids, and lipids to recipient cells. MSC-EVs recapitulate the functions of the cells they originate, including immunoregulatory effects but do not seem to be associated with the limitations and concerns of cell-based therapies, thereby emerging as an appealing alternative therapeutic option in immune-mediated disorders. In the present review, the biology of MSCs will be outlined and an overview of their immunomodulatory functions will be provided. In addition, current knowledge on the features of MSC-EVs and their immunoregulatory potential will be summarized. Finally, therapeutic applications of MSCs and MSC-EVs in autoimmune disorders will be discussed

Chitosan/gelatin scaffolds support bone regeneration

Chitosan/Gelatin (CS:Gel) scaffolds were fabricated by chemical crosslinking with glutaraldehyde or genipin by freeze drying. Both crosslinked CS:Gel scaffold types with a mass ratio of 40:60% form a gel-like structure with interconnected pores. Dynamic rheological measurements provided similar values for the storage modulus and the loss modulus of the CS:Gel scaffolds when crosslinked with the same concentration of glutaraldehyde vs. genipin. Compared to genipin, the glutaraldehyde-crosslinked scaffolds supported strong adhesion and infiltration of pre-osteoblasts within the pores as well as survival and proliferation of both MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells after 7 days in culture, and human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) after 14 days in culture. The levels of collagen secreted into the extracellular matrix by the pre-osteoblasts cultured for 4 and 7 days on the CS:Gel scaffolds, significantly increased when compared to the tissue culture polystyrene (TCPS) control surface. Human BM-MSCs attached and infiltrated within the pores of the CS:Gel scaffolds allowing for a significant increase of the osteogenic gene expression of RUNX2, ALP, and OSC. Histological data following implantation of a CS:Gel scaffold into a mouse femur demonstrated that the scaffolds support the formation of extracellular matrix, while fibroblasts surrounding the porous scaffold produce collagen with minimal inflammatory reaction. These results show the potential of CS:Gel scaffolds to support new tissue formation and thus provide a promising strategy for bone tissue engineering. © 2018, Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature

The Role of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Derived Extracellular Vesicles (MSC-EVs) in Normal and Abnormal Hematopoiesis and Their Therapeutic Potential

Mesenchymal stem cells (MSCs) represent a heterogeneous cellular population responsible for the support, maintenance, and regulation of normal hematopoietic stem cells (HSCs). In many hematological malignancies, however, MSCs are deregulated and may create an inhibitory microenvironment able to induce the disease initiation and/or progression. MSCs secrete soluble factors including extracellular vesicles (EVs), which may influence the bone marrow (BM) microenvironment via paracrine mechanisms. MSC-derived EVs (MSC-EVs) may even mimic the effects of MSCs from which they originate. Therefore, MSC-EVs contribute to the BM homeostasis but may also display multiple roles in the induction and maintenance of abnormal hematopoiesis. Compared to MSCs, MSC-EVs have been considered a more promising tool for therapeutic purposes including the prevention and treatment of Graft Versus Host Disease (GVHD) following allogenic HSC transplantation (HSCT). There are, however, still unanswered questions such as the molecular and cellular mechanisms associated with the supportive effect of MSC-EVs, the impact of the isolation, purification, large-scale production, storage conditions, MSC source, and donor characteristics on MSC-EV biological effects as well as the optimal dose and safety for clinical usage. This review summarizes the role of MSC-EVs in normal and malignant hematopoiesis and their potential contribution in treating GVHD