Adenosine A2A receptors in the rat hippocampus: stress related changes

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009O stresse modula a função cerebral e a cognição. Situações de stresse excessivo podem induzir alterações morfológicas e funcionais no cérebro com consequências cognitivas. Estudos clínicos têm vindo a demonstrar que o stresse pode estar relacionado com uma vulnerabilidade aumentada para sofrer de desordens psiquiátricas como a depressão e a ansiedade. Os modelos de stresse que melhor parecem reproduzir o que se observa clinicamente são aqueles em que este é induzido durante a infância, num período de grande desenvolvimento neuronal. Os estudos publicados indicam que eventos traumáticos ocorridos no período pós-natal têm um efeito permanente no cérebro. Um dos modelos mais aceites e utilizados pela comunidade científica como paradigma de stresse crónico no adulto consiste na perturbação da relação mãe-filho, em animais de laboratório, denominado de separação maternal. A aplicação deste protocolo resulta em níveis plasmáticos de corticosterona permanentemente elevados bem como em alterações no sistema nervoso central. Uma das estruturas cerebrais mais sensíveis ao stresse é o hipocampo, área cerebral crucial na aprendizagem e memória. A adenosina é um importante neuromodulador da excitabilidade neuronal do hipocampo tendo acções importantes, não só na transmissão basal, mas também na plasticidade sináptica. Os seus efeitos são mediados principalmente por dois receptores, os receptores A1, com acções principalmente inibitórias e presentes em grande densidade; e os receptores A2A, com acções maioritariamente excitatórias e que apresentam baixos níveis de expressão nesta área cerebral. Alterações na densidade destes receptores foram observadas em diversas condições, como actividade convulsiva, em modelos de doenças neurodegenerativas ou mesmo como consequência do envelhecimento. A alteração nos níveis dos receptores da adenosina tem consequências na sua acção neuromoduladora interferindo com a normal regulação da excitabilidade neuronal. O objectivo do presente trabalho foi o de avaliar, na idade adulta, o efeito de um stresse crónico, induzido logo após o nascimento, nos receptores de adenosina. Foram também avaliadas diversas proteínas intervenientes em processos de plasticidade e memória que podem estar envolvidas no aumento da susceptibilidade do hipocampo como consequência do stress. Ratos machos da estirpe Wistar foram divididos em dois grupos, controlo (CTR) e separação maternal (MS-Maternal Separation). O grupo MS foi separado da mãe diariamente, do dia 2 ao dia 14 de idade, durante 3 horas, enquanto o grupo controlo permaneceu não manipulado. Entre as 6 e as 8 semanas de idade, os animais foram sacrificados e várias áreas cerebrais (hipocampo, córtex e estriado) utilizadas para ensaios de ligação e Western Blotting. Os níveis dos receptores A1 e A2A de adenosina foram quantificados por ensaios de ligação utilizando antagonistas selectivos para os receptores de adenosina do subtipo A1 (DPCPX, 0- 10 nM) e A2A (ZM 241385, 0-10nM) ou por Western Blotting nas várias áreas cerebrais. A separação maternal induziu, no hipocampo, um aumento de 56,2±9,4 % (n=3; p<0,05) nos níveis de receptores do subtipo A2A , obtido por Western Blotting e uma diminuição de 1202±68 fmol/mg (n=4) para 1073±48 fmol/mg (n=4) dos receptores do subtipo A1. Nas restantes áreas cerebrais não foram observadas diferenças nos níveis destes receptores. As alterações induzidas pelo stress nos níveis dos receptores de adenosina seguem a mesma tendência daquelas que ocorrem com o envelhecimento, onde foi observada uma alteração na interacção entre estes receptores. Com o objectivo de estudar a interacção A1/A2A em condições de stress realizaram-se curvas de deslocamento, na presença e ausência de um agonista selectivo para os receptores do subtipo A2A (CGS 21680 – 30nM). Estas curvas foram realizadas promovendo o deslocamento da DPCPX (2 nM) um antagonista selectivo dos receptores do subtipo A1 pela CPA (0-6 μM) um agonista selectivo dos mesmos receptores. Não foram observadas alterações a este perfil de deslocamento entre animais CTR e MS, na presença ou ausência de CGS 21680. A localização regional dos efeitos do stresse nos níveis dos receptores de adenosina, com impacto predominante no hipocampo, conduziu à quantificação dos níveis dos receptores de glucocorticoides e mineralocorticoides nas várias áreas cerebrais por Western Blotting. Estes são os receptores citoplasmáticos para a corticosterona e são fundamentais na mediação da resposta ao stress. Têm ambos uma expressão elevada no hipocampo e alterações na sua razão (MR/GR) implicam alterações nas propriedades neuronais e em fenómenos de plasticidade e memória. A separação maternal induziu, em todas as áreas cerebrais estudadas, uma diminuição nos níveis dos receptores de glucocorticoides sem modificações nos níveis dos receptores de mineralocorticoides. Estas alterações tiveram maior impacto no hipocampo (26,1±4,5% ;P<0,05; n=3) comparando com o córtex (16,3 ±3,4%; P<0,05; n=4) ou o estriado (9,6 ± 2,6%; P<0,05; n=4). Com o objectivo de explorar o potencial impacto destas alterações na função do hipocampo, foram avaliadas várias proteínas envolvidas na transmissão sináptica ou em processos de plasticidade. Foram investigadas alterações nos níveis da subunidade 1 do receptor AMPA para o glutamato (GluR1), da subunidade β3 do receptor GABAA (β3-GABAA), do receptor TrkB, do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e do receptor 1 da hormona de libertação da corticotrofina (CRH-R1). A separação maternal induziu alterações nos níveis de todas estas proteínas no hipocampo. Observa-se uma diminuição dos níveis de GluR1 (25%±5%; P<0,05;n=3), de β3-GABAA (16±2%; P<0,05; n=3) e dos receptores TrkB (17±2,3%; n=3;P<0,05) e um aumento de DBNF (67±13%; n=4; P<0,05) e do CRH-R1 (55±7%; P<0,05; n=3). Estas alterações mostram que o stress crónico numa fase precoce da vida, induz modificações permanentes no cérebro, principalmente no hipocampo que envolvem tanto a transmissão inibitória como excitatória. Os receptores GABAA são os receptores ionótropicos do principal neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central e a diminuição dos níveis da subunidade β3 deste receptor pode traduzir-se em alterações permanentes na neurotransmissão inibitória. Por outro lado, tanto a inserção de receptores AMPA contendo a subunidade GluR1 como a expressão dos receptores TrkB são importantes na indução da potenciação de longa duração (LTP). As alterações observadas nos níveis destes receptores poderão justificar a diminuição da LTP já observada em animais submetidos a separação maternal. Com o objectivo de avaliar se todas estas alterações ocorriam em paralelo com modificações na densidade sináptica utilizou-se a sinaptofisina como marcador sináptico e avaliaram-se, por Western Blotting, alterações nos níveis desta proteína entre animais CTR e MS. Não se observaram alterações na densidade sináptica, detectáveis pela técnica utilizada. Assim, este trabalho vem mostrar que a indução de stresse num período de grande desenvolvimento neuronal se traduz em alterações permanentes no cérebro, detectáveis na idade adulta, com especial impacto no hipocampo. Estas alterações envolvem várias proteínas intervenientes não só na transmissão sináptica basal mas também em fenómenos de plasticidade, tendo consequentemente implicações funcionais na memória. Mostra-se ainda, pela primeira vez, que num modelo de stress crónico usado no estudo de psicopatologias, os receptores da adenosina estão alterados. O facto de estas alterações seguirem um padrão semelhante ao que aconece no envelhecimento sugere que o stress pode aumentar a susceptibilidade do hipocampo não apenas para futuros insultos, mas pode também exacerbar os défices cognitivos que acompanham o próprio envelhecimento Estes resultados suportam ainda a utilização de antagonistas selectivos dos receptores A2A, que têm sido propostos como antidepressivos em outros modelos.Stress induced early in life interferes with the establishment, maintenance and development of neuronal networks. Some of these changes share similarities with those observed in aging. An imbalance in the density of the adenosine A1 and A2A receptors in the hippocampus and striatum of aged animals, was previously reported. We now investigated if the induction of chronic stress, through maternal separation, could have a similar impact on adenosine receptors and related proteins in the hippocampus, striatum and cortex. Male Wistar rats were assigned to either control (CTR) or maternal separated (MS) group. The MS were separated from their mothers for 3h/day (2-14 postnatal days) while CTR were left undisturbed. At 7-8 weeks of age they were sacrificed, the hippocampi and striata dissected and processed. Saturation binding curves with the selective antagonist for A1 receptors, [3H]DPCPX (0-7 nM) or the selective antagonist for A2A receptors, [3H]ZM 241385 (0-7 nM) were performed. The displacement of [3H]DPCPX (2 nM) by the selective A1 receptor agonist, CPA (0-6 μM) in the presence of the selective A2A receptor agonist, CGS 21680 (30 nM) was assessed. The levels of A1 and A2A receptors, GR and MR, GABAA-β3, GluR1, CRH-R1, TrkB and synaptophysin were quantified by immunoblot analysis. The hippocampus was the only area with changes in the levels of adenosine receptors. A2A receptors were found to be increased by 56.2±9.4 % (n=3; P<0.05) and A1 slightly decreased (1202±68 fmol/mg (n=4) to 1073±48 fmol/mg (n=4)) in MS compared to CTR animals. These changes were not accompanied by alterations in the affinity pattern of A1 receptors induced by activation of A2A receptors. A region specific effect was further confirmed by observing that the MR/GR ratio was decreased more markedly in the hippocampus of MS animals than in other brain areas. A decrease of 26.1±4.5 % (n=3, P<0.05) in the levels of GR was observed in the hippocampus compared to a decrease of 16.3±3.4 % (n=4, P<0.05) in cortex and of 9.6±2.6 % (n=4, P<0.05) in striatum. MS had also an impact in hippocampal markers of synaptic plasticity. GluR1 subunit, GABAA-β3 and TrkB receptors were decreased (n=3, P<0.05) while BDNF and CRH-R1 were increased (n=3-4, P<0.05). Overall these data show that stress induces long-term changes in the hippocampus, impacting on the levels of adenosine receptors and related synaptic plasticity markers, in an “early-ageing” phenomenon. Moreover, these also suggest long-term consequences for hippocampal function that may imply increased susceptibility of this brain area for further insults. Finally, the data obtained further support the involvement of adenosine receptors in psycopathologies and the blockade of A2A receptors as therapeutical approach against stressinduced cognitive impairments

Interaction between glucocorticoid and adenosine A2A receptors in the hippocampus : implications for learning and memory

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014(CaMKII) promoter were evaluated. A2AR overexpression in rats lead to a shift in adenosine neuromodulation, from a protein kinase C- to a protein kinase A- dependent signaling, much similar to what is observed upon aging. This was also present in stressed animals and reverted by blocking A2AR, providing the first evidence that an abnormal A2AR signaling can be the trigger to pathology. Additionally it was shown that the neuronal increase in A2AR is sufficient to drive hippocampal dependent memory impairments and to modify synaptic plasticity in an age-like manner. Interestingly, A2AR overexpression also induces a dysfunction in HPA-axis by increasing circulating corticosterone levels, revealing again, an involvement of A2AR in the control of stress response. Finally it was shown that A2AR blockade decreases GR/GRE (glucocorticoid receptor/glucocorticoid response element) transcriptional activity in a neuroblastoma cell line. This is probably due to their ability to modify GR nuclear translocation induced by the GR analogue, dexamethasone, since we observed a prevention of this translocation by blocking A2AR. This has important consequences for synaptic plasticity: the impairments in hippocampal synaptic plasticity induced by GR activation are more profound under A2AR overexpression and are prevented if A2AR are blocked. Additionally, A2AR blockade therapy in vivo increased hippocampal histone H3 acetylation of the Nr3c1 gene encoding GR and GR mRNA levels. Globally it is now possible to conclude that A2AR dysfunction, depending on their levels and signaling targets, has an instrumental role in stress and aging, driving memory and synaptic plasticity impairments. Together, these results suggest that A2AR directly modulate GR, unveiling an important therapeutic alternative to GR antagonists for clinical applications. These findings are significant for the treatment of not only psychopathologies but can also be extended to the multiple age-related conditions where glucocorticoid response is impaired.O stresse crónico e o envelhecimento estão ambos associados a um aumento dos níveis plasmáticos de corticosterona e a uma disfunção do eixo hipotalâmico hipofisário (HPA, do inglês Hypotalamic-Pituitary-Adrenal). Estas alterações têm efeitos deletérios para a função cerebral com comprometimento da função neuronal, da plasticidade sináptica estando frequentemente associadas a danos cognitivos, tudo isto consequência da activação dos receptores de glucocorticóides (GR, do inglês glucocorticoid receptors). Os receptores A2A de adenosina (receptores A2A) são receptores acoplados a proteínas G constitutivamente activados e, no cérebro, um dos principais mediadores da resposta ao neuromodulador homeostático, a adenosina. Ao longo do envelhecimento e com o stresse, ocorre um desequilíbrio dos níveis destes receptores e alguns estudos sugerem que o seu bloqueio pode mesmo prevenir os efeitos do stresse. Contudo, não era ainda conhecido até que ponto os receptors A2A estariam envolvidos na disfunção neuronal e nos efeitos mediados pelo stresse. Assim, os objectivos desta tese foram: em primeiro lugar, avaliar se o bloqueio dos receptores A2A poderia reverter os efeitos deletérios originados pelo stresse, clarificando deste modo a importância destes receptores; segundo, avaliar se um aumento dos receptores A2A seria suficiente para originar défices ao nível do hipocampo e em terceiro lugar, se os receptores A2A poderiam modular os efeitos dos GR, sendo este o mecanismo pelo qual estariam a conduzir ao dano e à disfunção neuronal. Submetemos ratos Wistar machos a um paradigma de stresse por separação maternal. Neste protocolo, os animais são separados das mães durante 3 horas por dia, do dia 2 ao dia 14 de vida. Quando avaliados na idade adulta às 8 semanas, estes animais apresentam um comprometimento da memória dependente do hipocampo e da plasticidade sináptica. Para estudar o envolvimento dos receptores A2A nestes défices e o seu potencial terapêutico, os animais foram tratados com KW6002, um antagonista selectivo dos receptores A2A, a partir das 6 semanas de vida, durante pelo menos um mês, período após o qual foram avaliados em testes de comportamento animal. A administração de KW6002 reverteu os défices de memória e o comportamento ansioso apresentado por estes animais. As alterações na plasticidade sináptica, avaliadas na sinapse fibras de Schaffer/dendrites de CA3 do hipocampo, e na arborização dendrítica foram também revertidas. A função do eixo HPA foi também avaliada: os animais sujeitos a separação maternal não apresentaram uma variação circadiária fisiológica dos corticosteróides, com níveis de corticosterona no plasma elevados permanentemente. Após o tratamento, os níveis plasmáticos desta hormona reduziram e a variação circadiária foi reestabelecida. Estes resultados revelam assim um papel instrumental dos receptores A2A nos danos causados pelo stresse e o seu potencial terapêutico para diversas patologias. Com o objectivo de explorar em maior detalhe o papel dos receptores A2A na origem da disfunção do hipocampo, que ocorre tanto com o envelhecimento como com o stresse, os efeitos que advêm da sobreexpressão deste receptor foram avaliados. Utilizaram-se ratos transgénicos com sobreexpressão do receptor A2A humano controlada pelo promotor da CaMKII, abundante em neurónios do córtex e hipocampo. A sobreexpressão de receptores A2A alterou a neuromodulação adenosinérgica de forma muito semelhante ao envelhecimento. Isto também foi observado em animais sujeitos a separação maternal e revertido com o tratamento com o antagonista dos receptores A2A. Adicionalmente, demonstrou-se que o aumento neuronal dos receptores A2A é suficiente para gerar défices na memória dependente do hipocampo e para modificar a plasticidade sináptica de forma similar à que ocorre no envelhecimento. É interessante notar que todos estes efeitos ocorrem associados a uma disfunção dos eixo HPA, também consequência do aumento destes receptores. Isto revela novamente um papel importante dos receptores A2A no controlo da resposta ao stresse. Era então fundamental compreender se a acção dos receptores A2A na modulação dos efeitos do stresse se devia: 1) apenas a um efeito indirecto na função do hipocampo, e como consequência no eixo HPA (O hipocampo tem um importante papel inibitório do eixo HPA como resposta a níveis plasmáticos elevados de corticosterona); ou 2) a uma acção directa nos GR. O efeito de activar ou bloquear os receptores A2A na actividade transcripcional e localização nuclear dos GR foram avaliados. O bloqueio dos receptores A2A diminuiu a actividade transcripcional dos GR e impediu a sua translocação nuclear induzida por um agonista selectivo. As consequências desta interacção para fenómenos de plasticidade sináptica foram também avaliadas. Observou-se que os efeitos deletérios de activar os GR são prevenidos pelo bloqueio dos receptores A2A e aumentados quando estes são sobreexpressos. Assim estes resultados revelam um papel crucial dos receptores A2A nos efeitos dos GR sugerindo até que possa ser este o mecanismo pelo qual o seu bloqueio se tem revelado benéfico em patologias tão diversas. Globalmente é agora possível concluir que alterações nos receptores A2A, ao nível quer da densidade quer da sinalização, têm um papel instrumental nos efeitos do stresse e do envelhecimento na memória e na plasticidade sináptica. Estes dados apoiam a utilização terapêutica de antagonistas dos receptores A2A em inúmeras patologias. Os resultados agora apresentados constituem também a primeira evidência de que os receptores A2A tem um papel directo no controlo dos efeitos dos glucocorticoides e na função do eixo-HPA, sendo esta uma explicação totalmente nova do mecanismo subjacente aos efeitos benéficos dos antagonistas A2A.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

A2A adenosine receptor deletion is protective in a mouse model of Tauopathy

© 2016 Macmillan Publishers Limited All rights reserved. This work is licensed under a Creative Commons Attribution- NonCommercial-NoDerivs 4.0 International License. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license, unless indicated otherwise in the credit line; if the material is not included under the Creative Commons license, users will need to obtain permission from the license holder to reproduce the material. To view a copy of this license, visit http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Consumption of caffeine, a non-selective adenosine A2A receptor (A2AR) antagonist, reduces the risk of developing Alzheimer's disease (AD) in humans and mitigates both amyloid and Tau burden in transgenic mouse models. However, the impact of selective A2AR blockade on the progressive development of AD-related lesions and associated memory impairments has not been investigated. In the present study, we removed the gene encoding A2AR from THY-Tau22 mice and analysed the subsequent effects on both pathological (Tau phosphorylation and aggregation, neuro-inflammation) and functional impairments (spatial learning and memory, hippocampal plasticity, neurotransmitter profile). We found that deleting A2ARs protect from Tau pathology-induced deficits in terms of spatial memory and hippocampal long-term depression. These effects were concomitant with a normalization of the hippocampal glutamate/gamma-amino butyric acid ratio, together with a global reduction in neuro-inflammatory markers and a decrease in Tau hyperphosphorylation. Additionally, oral therapy using a specific A2AR antagonist (MSX-3) significantly improved memory and reduced Tau hyperphosphorylation in THY-Tau22 mice. By showing that A2AR genetic or pharmacological blockade improves the pathological phenotype in a Tau transgenic mouse model, the present data highlight A2A receptors as important molecular targets to consider against AD and Tauopathies.This work was supported by grants from France Alzheimer (to DB) and LECMA/Alzheimer Forschung Initiative (to DB and CEM). DB and LVL got a Égide/Pessoa program EU exchange grant. Our laboratory is also supported by the LabEx (excellence laboratory) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to ALZheimer’s disease), Inserm, CNRS, Université Lille 2, Lille Métropole Communauté Urbaine, Région Nord/Pas-de-Calais, FEDER, DN2M, ANR (ADONTAGE and ADORATAU, to DB) and FUI MEDIALZ. We thank the animal facility of IMPRT-IFR114 and M Besegher, I Brion, D Cappe, R Dehaynin, J Devassine, Y Lepage, C Meunier and D Taillieu for transgenic mouse production and animal care, as well as M Basquin, D Demeyer, S Eddarkaoui, H Obriot and M Schneider for support. CL holds a doctoral grant from Lille 2 University, and SB from Région Nord Pas de Calais and CHRU de Lille. VF holds a grant from Région Nord-Pas-de-Calais and Inserm. EF holds a post-doctoral grant from Région Nord-Pas-de-Calais (DN2M). LVL is an Investigator FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Projeto Europeu IDEUS - Implementation of Dedicated Education Units in Europe: formação de mentores clínicos

Trabalho apresentado no 4º Congresso Nacional de Práticas Pedagógicas no Ensino Superior, 13-14 julho 2017, Setúbal, PortugalN/

Maternal separation impairs long term-potentiation in CA1-CA3 synapses and hippocampal-dependent memory in old rats

© 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.Exposure to chronic stress during the neonatal period is known to induce permanent long-term changes in the central nervous system and hipothalamic-pituitary-adrenal axis reactivity that are associated with increased levels of depression, anxiety, and cognitive impairments. In rodents, a validated model of early life stress is the maternal separation (MS) paradigm, which has been shown to have long-term consequences for the pups that span to adulthood. We hypothesized that the early life stress-associated effects could be exacerbated with aging, because it is often accompanied by cognitive decline. Using a MS model in which rat pups were separated from their mothers for 3 hours daily, during postnatal days 2-14, we evaluated the long-term functional consequences to aged animals (70-week-old), by measuring synaptic plasticity and cognitive performance. The baseline behavioral deficits of aged control rats were further exacerbated in MS animals, indicating that early-life stress induces sustained changes in anxiety-like behavior and hippocampal-dependent memory that are maintained much later in life. We then investigated whether these differences are linked to impaired function of hippocampal neurons by recording hippocampal long-term potentiation from Schaffer collaterals/CA1 synapses. The magnitude of the hippocampal long-term potentiation induced by high-frequency stimulation was significantly lower in aged MS animals than in age-matched controls. These results substantiate the hypothesis that the neuronal and endocrine alterations induced by early-life stress are long lasting, and are able to exacerbate the mild age-associated deficits.Vasco C Sousa and Vânia L Batalha were supported by a grant from Fundação para a Ciência e Tecnologia; Luisa Vaqueiro Lopes is an Investigator FCT, funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia and Bial.info:eu-repo/semantics/publishedVersio