Plasmodium infection of mammalian host : effects of vitamin D

Tese de mestrado em Microbiologia Clínica, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2008Malaria is one of the most important parasitic infectious diseases in terms of human and economical losses in developing countries. This disease is caused by Plasmodium and is transmitted to the vertebrate host by Anopheles mosquitoes. During malaria infection, Plasmodium parasites infect firsthepatocytes and after the erythrocytes, here being responsible for serious pathological complications and some times to death. These two obligatory parasite developmental stages give to scientists two different approaches to fight malaria. The first, in the liver, preventing malarial disease associated symptoms and the second in the blood, to attenuating exacerbated clinical complications. Vitamin D, and particularly its active metabolite, 1,25_(OH)2D3, have been showed to be a potent immunoregulator. 1,25_(OH)2D3 can tune the immune system towards an anti-inflammatory state. Paradoxically, vitamin D is also associated with the production of antimicrobial peptides by the innate immune system. In the present work we decided to take advantage of the particular immunoregulatory properties of 1,25_(OH)2D3 to study a potential antimicrobial effect in the Plasmodium Berghei liver stage and a potential anti inflammatory effect in a cerebral malaria rodent model. In the P. berghei liver stage infection our results show a in vitro reduction in the of infection of 1,25_(OH)2D3 treated human Huh7 and mouse Hepa1-6 hepatoma cell lines by flow cytometry. In vivo, no differences were observed between 1,25_(OH)2D3 treated and untreated infected C57/Bl6 mice livers. However, lower doses of 1,25_(OH)2D3 tend to reduced infection whether higher doses show the opposite tendency. 1,25_(OH)2D3 had no effect in the outcome of cerebral malaria in a murine cerebral malaria model. In conclusion, 1,25_(OH)2D3 might have a potential antimicrobial effect in P. berghei liver stage. However, further studies should be made.A Malária é uma das mais importantes doenças infecciosas no que respeita a perdas humanas e económicas nos paises em vias de desenvolvimento. Esta doença é causada pelo Plasmodium e é transmitida ao hospedeiro vertebrado por mosquitos Anopheles. Estes parasitas , no hospedeiro vertebrado, infectam primeiro hepatocitos e seguidamente os eritrocitos, fase responsável por complicações patologica séria que levam por vezes à morte. Estas duas fases de desenvolvimento necessárias ao parasita dão aos cientistas duas abordagens diferentes para combater a m alaria. A primeira, no fígado, prevenindo os sintomas associados a esta doença e a seguinda, no sangue, atenuando as complicações clinicas. A vitamina D, e em particular a sua forma activa, 1,25_(OH)2D3, são potentes reguladores do sistema imune. 1,25_(OH)2D3 pode modular o sistema imune para um estado anti-inflamatório. Paradoxalmente, a vitamina D está também associada com a produção de péptidos antimicrobianos pelo sistema imune. No presente trabalho decidimos tirar partido das propriedades imunoregulatorias de 1,25_(OH)2D3 e estudar tanto potenciais efeitos antimicrobianos na fase hepática como potenciais efeitos anti-inflamatórios na fase sanguinea da infecção pelo Plasmodium Berghei tendo por modelo roedores. Durante a fase hepatica da infecção do P. Berghei os nossos resultados mostram uma redução in vitro da infecção de linhas celulares de hepatoma de ratinho (Hepa1-6) e humano (Huh7), quando tratadas com 1,25_(OH)2D3 por citometria de fluxo. In vivo, não foram observadas diferenças entre a infecção de figados de ratinhos C57/Bl6 tratados ou não com 1,25_(OH)2D3. Contudo, ratinhos sugeitos a doses reduzidas de 1,25_(OH)2D3 mostraram uma tendência para ter uma nenor infecção, enquanto doses mais altas mostraram uma tendência inversa. 1,25_(OH)2D3 não teve qualquer efeito no resultado final no modelo de malaria cerebral.Em conclusão, 1,25_(OH)2D3 poderá ter um efeito antimicrobiano na fase hepática do P. Berghei. Contudo, deverão ser efectuados mais estudos

Projecto AVAC para um edfício habitacional multifamiliar

Neste trabalho são apresentados os resultados comparativos, na vertente económica de aquisição e exploração, entre dois tipos de sistemas de climatização sendo estes, respectivamente, do tipo expansão indirecta a água e do tipo expansão directa de volume de refrigerante variável doravante designado pelas siglas (VRV), para um edifício de habitação multifamiliar. Para tal recorreu-se a um software de simulação e de cálculo térmico, de referência, para determinar as cargas térmicas a que o edifício em estudo estará sujeito, no qual se baseou toda a selecção e o dimensionamento dos equipamentos pertencentes aos dois tipos de sistemas de climatização em estudo. Foram efectuados vários estudos comparativos, que poderão futuramente, ajudar os profissionais que trabalham no ramo a proceder à selecção de qual o tipo de sistema a adoptar face a várias condicionantes e variáveis características de cada espaço

The role of electrostatics in the mechanism of ATP/ADP carrier function: an in silico study

Tese de mestrado em Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020As forças electrostáticas têm um papel fulcral numa extensa panóplia de processos biomoleculares desde expressão de genes, resposta imune, condução de moléculas até centros catalíticos, acoplamento de subunidades, entre outros. A grande ubiquidade destas prende-se com a sua habilidade de actuarem a longas distâncias. Assim sendo, a capacidade de descrever as forças electrostáticas associadas aos diversos processos é uma ferramenta extremamente útil, porém, infelizmente, o seu estudo com detalhe atomístico é bastante difícil de realizar através de métodos experimentais. Desta forma os métodos computacionais têm vindo a ganhar relevância tanto pelo grande aumento de poder computacional nas últimas décadas, como também pela sua capacidade de colmatar esta lacuna a nível experimental. Com isto em mente, o presente trabalho pretende demonstrar um protocolo computacional efectivo no estudo das propriedades electrostáticas de sistemas moleculares de grandes dimensões e complexidade. O objecto de estudo escolhido para a validação deste protocolo foi a proteína transportadora de ATP/ADP (AAC), responsável por importar o ADP para a matriz mitocondrial e exportar ATP da matriz para o espaço inter-membranar do mitocôndrio. Sendo capaz de atrair e transportar moléculas altamente negativas aponta imediatamente para a presença de uma superfície electrostática complexa e essencial para que o processo ocorra eficientemente. A somar às características mencionadas anteriormente, o facto deste transportador estar bem caracterizado e estudado torna-o um bom candidato a usar na demonstração de um protocolo de estudo da electrostática associada a processos biomoleculares. Para concretizar este estudo três técnicas computacionais foram utilizadas funcionando em complementaridade. Primeiramente simulações longas de dinâmica molecular foram realizadas, após a inserção do transportador de ATP/ADP em membranas de POPC. Com estas torna-se possível avaliar a estabilidade do nosso sistema proteína-membrana, verificando a viabilidade das condições escolhidas. Efectivamente foi observado que o uso do método de campo de força generalizado para o tratamento da electrostática a longa distância introduziu instabilidades estruturais nas simulações. Assim, foi necessário readaptar o nosso protocolo aplicando o método de somas de Ewald com malha de partículas para o tratamento da electrostática a longa distância. Procedendo a esta alteração no tratamento das nossas simulações torna-se possível equilibrar o nosso sistema de modo a ser empregue na técnica de Dinâmica Molecular a pH Constante (CpHMD). Esta acrescenta um nível de detalhe à descrição do sistema ao permitir a ocorrência de eventos de (des)protonação numa lista definida de moléculas e/ou resíduos de aminoácido. Realizando simulações de CpHMD em ambos os estados, C e M, do AAC em forma apo e a quatro valores de pH, 4, 5, 6 e 7, torna-se possível obter curvas de titulação e valores de pKa para diversos aminoácidos presentes no transportador de membrana. Analisando a presença de desvios nos pKa detectados nas nossas simulações de CpHMD torna-se possível a discussão acerca do seu ambiente circundante e de possíveis interacções electrostáticas entre resíduos da proteína. Destas simulações fomos capazes de identificar um grande desvio no pKa da lisina 22, trazendo o seu valor de 10.4, quando solvatado, para ∼ 8. Este desvio fora já reportado em publicações anteriores e, à semelhança do nosso trabalho, demonstra-se relevante para a actividade do transportador, uma vez que a forma protonada deste resíduo é essencial à actividade. Das nossas análises foi também possível identificar três resíduos ácidos na proteína cujo pKa se encontrava desviado para valores inferiores no estado C do AAC. Este desvio indica-nos a presença de interacções electrostáticas que estabilizam o estado carregado dos resíduos glutamato 29, aspartato 134 e aspartato 231. Efectivamente estas interacções consistem na formação de pontes salinas que ajudam no fecho da cavidade do AAC no estado C. Com estes resultados é possível demonstrar a utilidade do estudo de uma proteína através da técnica de CpHMD, sendo possível identificar resíduos chave para a actividade do transportador e interações cruciais para o bom funcionamento da proteína. Finalmente, pretendemos não só estudar a forma apo do AAC mas também o processo inteiro de transporte dos substratos através da proteína transmembranar com o intuito de obter uma descrição energética do processo e em simultâneo captar informações acerca das forças electrostáticas envolvidas neste. No entanto, as simulações tanto de MD como de CpHMD apenas são viáveis em pequenas escalas temporais, à volta de poucos microssegundos, já o tempo total do processo de transporte poderá chegar aos milissegundos. De forma a contornar este problema, será usada uma técnica de amostragem aumentada, Umbrella Sampling (US). Nesta, o processo de transporte é dividido em várias janelas segundo uma coordenada de reação e um potencial de enviesamento é aplicado ao substrato para o manter na posição definida. Desta forma, somos capazes de extrair a descrição energética do processo e os perfis de protonação não só do substrato como também dos resíduos do transportador de ATP/ADP. Conjugando os resultados dos dois tipos de transporte, importação de substrato para a matriz e exportação de substrato da matriz, para cada substrato, ATP e ADP, é possível comparar a totalidade de condições de transporte e esclarecer detalhes acerca do mecanismo executado pela proteína. Com as nossas simulações foi possível concluir que o mecanismo de importação dos substratos beneficia de diversos detalhes que não se encontram presentes no processo de exportação. Em primeira instância, através dos resultados obtidos da força potencial média (PMF) e da protonação de ambos os substratos, identificou-se a presença de um maior potencial electrostático positivo na cavidade do estado C, responsável pela captação de substrato no processo de importação. Este potencial conseguirá atrair os substratos do citoplasma para a cavidade a maiores distâncias do que o estado M. Aquando da comparação dos perfis energéticos de importação, foi observada a preferência energética da importação de ADP pelo seu perfil energético inferior relativamente ao do ATP. Já no caso da exportação, ambos apresentam perfis bastante semelhantes, não havendo um favorecimento do transporte de um substrato em particular. Por fim, os dois processos de transporte distinguem-se entre si também ao nível das redes de pontes salinas que executam o fecho da cavidade do estado C e M. Considerando o processo de importação, onde o estado C é responsável pela atração das moléculas, verificou-se a existência da rede de pontes salinas directamente no fundo da cavidade. Esta é constituída pelos resíduos ácidos mencionados nos resultados do CpHMD, Glu29, Asp134 e Asp231. Foi verificado que, ao ocorrer a aproximação do substrato ao fundo da cavidade do estado C, estes ácidos têm tendência a protonarem, o que leva, por consequência, ao enfraquecimento das pontes salinas e a uma mais rápida transição conformacional do estado C para o estado M. Em contrapartida, no processo de exportação, onde o estado M é responsável pela atracção dos substratos, a localização das pontes salinas encontra-se na extremidade citoplasmática da proteína, sendo assim insensível à presença do substrato no fundo da cavidade. Estas características distintas entre o estado C e M, relevantes para o processo de importação e exportação respectivamente, desenham um panorama que evidencia maior dificuldade na importação de substratos. In vivo, este processo é realizado ao atrair o ADP de um meio vasto e escasso em substrato junto da abertura do AAC para o interior da cavidade do estado C. Desta forma, a existência de um maior potencial positivo na cavidade, capaz de captar efectivamente o substrato, a presença de uma armadilha energética que previne a libertação natural do ADP de volta para o meio envolvente e uma mais rápida transição conformacional devido ao enfraquecimento das pontes salinas, aquando da aproximação do substrato, são características essenciais para que o processo de importação se dê com a eficiência e rapidez necessárias. Em contraste, no processo de exportação, o estado M atrai o ATP da matriz mitocôndrial, cujo volume é mais reduzido e onde existe uma grande abundância de substrato. Desta forma este estado não é submetido à pressão do ambiente para evoluir no sentido de aumentar a rapidez e eficiência do transporte, reflectindo-se na ausência das características observadas no estado C. Concluindo este trabalho, foi-nos possível demonstrar como o uso de técnicas computacionais permite um estudo detalhado e intensivo de um sistema de grandes proporções e complexidade, fornecendo informações cruciais acerca das forças electrostáticas e obtendo perfis energéticos que auxiliam na construção do mecanismo de acção da proteína. No presente caso, o protocolo foi usado numa proteína bem estudada e muito do seu mecanismo já fora elucidado. Porém, a aplicação deste mesmo protocolo numa proteína menos estudada poderá vir a revelar importantes detalhes sobre o seu mecanismo e levar à identificação de detalhes estruturais essenciais à actividade da proteína.To accurately describe the electrostatic interactions with atomistic detail is an exceedingly useful tool, since they play a major role in all biomolecular processes. In the present work, we introduced a new computational protocol based on Constant pH Molecular Dynamics (CpHMD) coupled to an Umbrella Sampling scheme (US-CpHMD). Using these techniques, we modeled the conformational changes of ATP/ADP carrier (AAC) coupled to the most relevant protonation events and even extracted the equilibrium energetics involved in the transport of ATP and ADP across the inner mitochondrial membrane. The transport activity of this protein is deeply connected with electrostatic interactions involved in the binding of the highly negative charged substrates. CpHMD simulations were performed on pre-equilibrated apo-AAC:POPC systems, allowing the extraction of titration curves and pKa values of several AAC residues. We were able to reproduce the reported pKa shift of Lys22 from the water soluble pKa value (10.4) to ∼ 8, which makes this residue the responsible for the sensitivity of this protein to basic pH values, modulating the activity of AAC. Three acid aminoacids, Glu29, Asp134 and Asp231, also showed shifted pKa values which revealed their role in establishing electrostatic interactions in the bottom of AAC cavity, forming the matrix salt-bridge network responsible for closing the C-state cavity. Taking a step further, US-CpHMD was used to mimic the transport of substrates while capturing conformational and electrostatic effects. Clear differences between the import and export process were detected in our analysis which are connected to the distinct evolutionary pressures of each transport. The import has developed a larger positive electrostatic potential in the cavity and a clear selectivity towards ADP in order to efficiently capture this molecule. In addition, we observed a substrate-induced shift in the protonation of the acid residues present on the matrix salt-bridge network. This protonation triggers the conformational transition from C- to M-state by weakening the matrix salt-bridges, leading to an acceleration of the import. These characteristics were of high importance for a quick and efficient import process, which is crucial due to the low abundance of the ADP near the C-state cavity. In contrast, from these features only a slightly weaker positive potential was present on the export process. The absence of the other traits is tied with the high abundance of ATP molecules near the M-state cavity and its almost unneeded selectivity over ADP, which is caused by a significantly lower magnitude of evolutionary pressure exerted in this process. Hence the M-state did not develop the same traits as the C-state. The entirety of results showed the success of employing this computational protocol in the analysis of mechanistic details at the atomic level, enabling the extraction of key electrostatic interactions and energetic profiles of the biomolecular process. The application of this protocol to less studied proteins and processes may prove highly advantageous, possibly aiding in the elucidation of their mechanism and key electrostatic details

Dificuldades sentidas no rastreio e estimulação cognitiva em pessoas idosas analfabetas e com baixa escolaridade

Face ao crescimento e à longevidade da população idosa, característicos da sociedade atual, torna-se cada vez mais necessário conhecer em pormenor o fenómeno do envelhecimento, em particular as especificidades deste tipo de população e eventuais necessidades que estejam por suprir. Com o aumento da esperança média de vida aumentou também o aparecimento de perturbações neurocognitivas, com maior prevalência em idades mais avançadas. Tendo como foco este público-alvo, especificamente as pessoas idosas analfabetas e com baixa escolaridade, procurar-se-á identificar e analisar, no presente estudo, as dificuldades que os profissionais de saúde e da área social sentem no rastreio e/ou na estimulação cognitiva destas pessoas idosas analfabetas ou com níveis de escolaridade baixos que são 470000 pessoas com mais de 65 anos. A abordagem escolhida foi a qualitativa, do tipo exploratório-descritivo. A amostra, selecionada através do método não probabilístico bola de neve, incluiu dez profissionais da área da saúde e/ ou da social. A recolha de dados foi realizada por meio de questionário sociodemográfico e por entrevista semiestruturada, realizada com recurso a videoconferência. Os dados recolhidos foram objeto de análise de conteúdo com recurso ao webQDA. Os resultados indicam as dificuldades que estes profissionais têm no rastreio e na estimulação cognitiva a pessoas idosas analfabetas ou com baixa escolaridade. Das dificuldades no rastreio destaca-se a dificuldade nas sessões de rastreio, por desconhecerem testes validados para pessoas idosas analfabetas e respetiva cotação. Na estimulação cognitiva a principal dificuldade foi a falta de uma intervenção cognitiva estruturada para população idosa analfabeta. Este estudo reforça a necessidade de capacitar os profissionais com competências para o rastreio e para a estimulação cognitiva das idosas analfabetas ou com baixa escolaridade, bem como promover o desenvolvimento de testes e programas de estimulação cognitivos adaptados a estas pessoas

Impact of a fall prevention education program on environmental adaptation and exercise self-efficacy in older adults

Objetivo Avaliar o impacto de um programa de educação de prevenção de quedas, na adaptação ambiental e autoeficácia para o exercício, em adultos mais velhos. Materiais e Métodos Foram avaliados vinte e seis participantes sendo estes divididos em dois grupos: I - grupo de controlo (n= 10) e II – grupo de intervenção (n= 16). Foram avaliados, nos períodos pré (T0) e pós intervenção (T1), através dos instrumentos: Checklist de Adaptação Ambiental e Escala de Autoeficácia para o Exercício. Resultados Principais Ambos os grupos continuaram com as atividades dinamizadas pela instituição em que estavam inseridas, sendo que o grupo II (intervenção) participou também num programa de educação para a prevenção de quedas, tendo obtido melhorias significativas em alguns parâmetros da Checklist de Adaptação Ambiental, enquanto que na Escala de Autoeficácia para o Exercício não existiram diferenças estatisticamente significativas entre T0 e T1. Conclusão Podemos inferir que um programa de educação focado na prevenção de quedas, poderá ter benefícios na adaptação do ambiente envolvente, permitindo assim, uma potencial diminuição de alguns dos fatores de risco de queda associados ao ambiente doméstico.ABSTRACT: Objective Evaluate the impact of a fall prevention education program on environmental adaptation and selfefficacy for exercise in older adults. Materials and Methods Twenty-six participants were evaluated and divided into two groups: I - control group (n= 10) and II - intervention group (n= 16). They were evaluated, in the periods before (T0) and after intervention (T1), through the instruments: Checklist of Environmental Adaptation and Self-efficacy Scale for the Exercise. Main results Both groups continued with the activities promoted by the institution in which they were inserted, and group II (intervention) also participated in a fall prevention education program, having obtained significant improvements in some parameters of the Environmental Adaptation Checklist, while in the Self-efficacy Scale for the Exercise there were no statistically significant differences between T0 and T1. Conclusion We can infer that an education program focused on fall prevention may have benefits in the adaptation of the surrounding environment, thus allowing a potential decrease of some of the fall risk factors associated with the domestic environment.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Human factors required for mycobacterium tuberculosis macrophage infection

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014Tuberculosis is a pathological manifestation of the infection by Mycobacterium tuberculosis in humans. Facultative intracellular parasites, like M. tuberculosis, evolved mechanisms to subvert the proper functioning of their host cells to their benefit. In this thesis we token advantage of the characteristics of the fluorescent proteins to develop methodologies based on fluorimetry to quantify the macrophage internalization and the number of intracellular mycobacteria. The application of these techniques allowed: 1) to demonstrate that the GFP expressing mycobacteria may be used to test the effects of new drugs namely pyrazinoic acid esters against M. tuberculosis growth in liquid cultures. However GFP is not a good fluorophore to quantify intracellular mycobacteria. Instead we found tdTomato the election fluorophore to this purpose 2) To determine the effect of 120 genes in the host vesicular traffic during macrophage infection with M. tuberculosis. We identified 10 genes, 8 lead to a reduction and 2 an increase of macrophage M. tuberculosis burden. 3) To demonstrate that a reduction in macrophage internalization was the cause for the reduction in intracellular M. tuberculosis observed in some of the genes identified in 2) and the modulation of internalization by the microRNA miR-142-3p. Additionally, we studied the effect of Rab GTPases silencing in exosome secretion. MicroRNAs (miR) are small non-coding RNA molecules that regulate gene expression. Previous studies in our laboratory shown that miR-142-3p was up-regulated during early stages of M. tuberculosis macrophage infection. MiR142-3p binds to Wasl gene controlling the expression of N-wasp protein involved in signal transduction of membrane receptors and actin cytoskeleton. N-wasp silencing reduces M. tuberculosis internalization by macrophage. These studies demonstrate that M. tuberculosis regulates its internalization through N-Wasp. Taken together our results demonstrate the effect of specific host factors in the survival and/or internalization of M. tuberculosis by macrophages. Tuberculosis bacilli apparently modulate some of them. The development of new molecules in formulations that inhibit resistant M. tuberculosis strains is another strategy for the eradication of this pathogen from humans.A tuberculose (TB) é a manifestação patológica da infecção do Mycobacterium tuberculosis no seu hospedeiro: os humanos. Esta doença afecta os humanos há milénios e constitui ainda um problema de saúde pública a nível global. A reemergência da TB após decadas de declínio resulta sobretudo da co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana e do aparecimento de estirpes de M. tuberculosis resistentes aos antibióticos. O M. tuberculosis é um parasita intracelular facultativo, cujo principal nicho de sobrevivência são os macrófagos: as células do sistema imune cuja função é a destruição dos microrganismos. Após fagocitado pelo macrófago, o M. tuberculosis subverte o normal funcionamento do seu hospedeiro. Os fagossomas contendo o bacilo da tuberculose não maturam para fagolisossomas, não fundindo com endossomas tardios ou lisossomas, protegendo o bacilo dos factores microbicidas do macrófago. Apesar de o fagossoma estar bloqueado num estádio precoce da sua maturação este funde com outras vesículas do macrófago hospedeiro, fornecendo à micobactéria recursos para a sobrevivência e replicação. Em particular, multiplas publicações sugerem que diferentes proteínas do hospedeiro reguladoras do tráfego vesicular ou do citoesqueleto da actina poderão desempenhar um papel relevante na sobrevivência deste patogénio. Contudo, os mecanismos através dos quais é estabelecida esta subversão não são conhecidos. O desenvolvimento de metodologias de larga escala para triagem no estudo dos factores do hospedeiro envolvidos na infecção de macrófagos, pelo M. tuberculosis, têm sido refreados pelas características únicas desta micobactéria. A única metodologia disponível para a quantificação de micobactérias intracelulares é a contagem de unidades formadoras de colónias (UFC), uma técnica laboriosa e dispendiosa. Nesta tese aproveitamos as características das proteínas fluorescentes para desenvolvermos metodologias para a quantificação da internalização e sobrevivência de micobactérias em macrófagos e em culturas líquidas. O desenvolvimento dessas técnicas permitiu: 1) Desenvolver uma metodologia baseada nas propriedades das proteínas fluorescentes para a determinação da sobrevivência de M. tuberculosis intracelularmente em macrófagos infectados. 2) Determinar o efeito de cerca de 120 genes humanos do tráfego vesicular na carga do M. tuberculosis em macrófagos humanos. 3) Estudar o efeito dos genes validados no ponto 2) e do micro RNA mIR143-3p na internalização do M. tuberculosis por macrófagos humanos. 4) Adicionalmente foi estudado o efeito do silenciamento de Rab GTPases na secreção de exosomas. De forma a desenvolver um método alternativo ao UFC compatível com a possibilidade de rastreamento em larga escala da sobrevivência de micobactérias aproveitamo-nos das características das proteínas fluorescentes com o objectivo de monitorizar a infecção de macrófagos pelo M. tuberculosis. Numa primeira fase culturas líquidas de M. tuberculosis expressando GFP foram sujeitos à acção microbicida de vários antibióticos e determinadas as suas concentrações mínimas inibitórias por fluorimetria. Posteriormente foram utilizados vários esteres derivados do ácido pirazinóico em M. tuberculosis expressando GFP por fluorimetria tendo-se quantificado a sua actividade biológica. Todos os compostos apresentaram uma maior actividade biológica que a pirazinamida ou o ácido pirazinóico. Compostos com maior comprimento da cadeia linear do álcool e maior lipofilia estão positivamente correlacionados com a actividade biológica. Apesar de adequado para a quantificação da inibição de crescimento de M. tuberculosis em culturas líquidas, a proteína GFP não se demonstrou propicia para a quantificação de micobactérias intracelulares. A quantificação por fluorimetria de M. tuberculosis intracelulares expressando a proteína fluorescente vermelha tdTomato, demonstrou-se uma boa alternativa ao UFC. Adicionalmente, a quantificação da intensidade da fluorescência de macrófagos humanos THP-1 expressando GFP, permitiu quantificar tanto o número como a viabilidade dos macrófagos. O estabelecimento de uma metodologia de rastreamento em larga escala para a quantificação de M. tuberculosis intracelular, permitiu-nos proceder ao silenciamento sistemático de cerca de 120 genes do tráfego vesicular humano e quantificar o seu efeito na carga de M. tuberculosis em macrófagos. Os candidatos obtidos no rastreamento foram posteriormente validados quanto à sua expressão genética. Identificámos 10 genes com efeito na carga intracelular de M. tuberculosis em macrófagos, em 2 genes, foi observado um aumento e em 8 genes, uma redução da carga de M. tuberculosis em macrófagos humanos. Os candidatos foram maioritariamente proteínas Rab, proteínas reguladoras e efectoras de Rab e proteínas do tráfego vesicular não classificadas. De forma a quantificar o contributo da internalização nos resultados observados no rastreamento dos 120 genes, desenvolvemos uma metodologia baseada em citometria de fluxo. Determinamos que, para micobactérias virulentas e avirulentas, a grande maioria dos genes testados são, provavelmente, reguladores positivos da internalização. Estas observações justificaram e confirmaram alguns dos resultados obtidos no rastreamento genómico e propõem um papel activo das micobactérias na modulação da sua internalização por macrófagos humanos. De forma a validar biologicamente alguns dos candidatos, estes foram silenciados novamente e foi quantificada a carga micobacteriana em macrófagos utilizando a metodologia convencional, as unidades formadoras de colónias. Com os resultados observados ficou demonstrado que a proteína Rab7a induz um aumento da carga macrofágica de M. tuberculosis. O silenciamento de Rab34 e Sintaxina 4 induz uma redução da carga de M. tuberculosis em macrófagos humanos sendo esta redução, possivelmente devida à redução da internalização nestas células. Os micro RNAs (miR), recentemente descritos, são uma nova classe de moléculas que controlam eventos pós-transcripcionais durante a expressão genética. Os miR ligam-se a regiões especificas do RNA mensageiro (RNAm) de uma proteína bloqueando a tradução proteica e/ou levando à degradação do RNAm. Os miRs controlam selectivamente a expressão de proteínas de diferentes vias metabólicas das células. Estudos feitos no nosso laboratório demonstraram que o miR-143-3p está sobre-expresso nos estádios iniciais da infecção de M. tuberculosis em macrófagos. O miR-143-3p liga-se ao mRNA do gene Wasl controlando a expressão da proteína N-Wasp, um transdutor de receptores membranares e do citoesqueleto de actina. O silenciamento da N-Wasp reduz a internalização de M. tuberculosis pelos macrófagos. Estes resultados demonstram a regulação de N-Wasp pelo M. tuberculosis para controlar a sua internalização. Os exossomas são vesículas com um diâmetro de 30 a 100 nm que são secretadas por diversos tipos de células. Os exossomas desempenham um papel importante na sinalização entre células e em macrófagos têm um papel de apresentação de antigénios. Os exossomas secretados por macrófagos infectados por M. tuberculosis são pró-inflamatórios in vitro e in vivo. No laboratório do Dr. Amigorena foi desenvolvida uma metodologia para quantificação de exossomas através de pérolas de latex conjugadas dom CD63 e a utilização de citometria de fluxo. Em colaboração com o Dr Ostrwsky, do laboratório do Dr Amigorena, Instituto Curie, Paris, França, efectuei um rastreio de larga escala para determinação dos genes do tráfego intracelular envolvidos na secreção de exossomas em células HeLa B6H4. Nesse estudo a proteína Rab27a e Rab27b foram envolvidas na secreção de exossomas em células humanas. Era nosso objectivo determinar se tal se verificava em macrófagos humanos, no contexto da infecção do M. tuberculosis, não foi possível por razões alheias à nossa vontade. Conjuntamente os dados apresentados nesta tese demonstram o efeito de factores específicos do hospedeiro que influenciam a sobrevivência e/ou internalização do M. tuberculosis por macrófagos, alguns deles aparentemente modulados pelo bacilo da tuberculose. Em particular, os dados sugerem que o M. tuberculosis desenvolveu um mecanismo específico de invasão dos macrófagos alveolares, provavelmente, para estabelecer o seu nicho replicativo sem activar em demasia o sistema imune do hospedeiro. Estes factores do hospedeiro, e em especial as proteínas que as codificam ou regulam são potenciais alvos para o desenvolvimento de drogas orientadas para a modulação do hospedeiro de forma a inibir ou controlar a infecção por M. tuberculosis. O desenvolvimento de novas drogas em formulações que inibam estirpes de M. tuberculosis resistentes é outra estratégia de erradicação deste patogénio nos humano.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

Virtual sign translator

In this paper authors present the overall study that includes the model developed (VS Model) and the experiences performed, with an automatic bidirectional sign language translator, between written and sign language, which is being supervised by the research group GILT (Graphics, interaction & learning technologies) under the frame of a national project called Virtual Sign (VS project). This project aims to develop and evaluate a model that facilitates access for the deaf and hearing impaired to digital content - in particular the educational content and learning objects - creating the conditions for greater social inclusion of deaf and hearing impaired people. Access to digital content will be supported by an automatic translator between Portuguese Writing (LEP) and Portuguese Sign Language (LGP) supported by an interaction model.FCT - Projeto VirtualSign - Ref. PTDC/CPE-CED/121878/201

Virtual sign : a real time bidirectional translator of portuguese sign language

Promoting equity, equal opportunities to all and social inclusion of people with disabilities is a concern of modern societies at large and a key topic in the agenda of European Higher Education. Despite all the progress, we cannot ignore the fact that the conditions provided by the society for the deaf are still far from being perfect. The communication with deaf by means of written text is not as efficient as it might seem at first. In fact, there is a very deep gap between sign language and spoken/written language. The vocabulary, the sentence construction and the grammatical rules are quite different among these two worlds. These facts bring significant difficulties in reading and understanding the meaning of text for deaf people and, on the other hand, make it quite difficult for people with no hearing disabilities to understand sign language. The deployment of tools to assist the daily communication, in schools, in public services, in museums and other, between deaf people and the rest may be a significant contribution to the social inclusion of the deaf community. The work described in this paper addresses the development of a bidirectional translator between Portuguese Sign Language and Portuguese text. The translator from sign language to text resorts to two devices, namely the Microsoft Kinect and 5DT Sensor Gloves in order to gather data about the motion and shape of the hands. The hands configurations are classified using Support Vector Machines. The classification of the movement and orientation of the hands are achieved through the use of Dynamic Time Warping algorithm. The translator exhibits a precision higher than 90%. In the other direction, the translation of Portuguese text to Portuguese Sign Language is supported by a 3D avatar which interprets the entered text and performs the corresponding animations

Using games to make the process of learning sign language enjoyable and interactive

Conferência realizada em Wellington, na Nova Zelândia, de 8-10 de dezembro de 2014The work presented in this paper consists in the development of a game to make the process of learning sign language enjoyable and interactive. In this game the player controls a character that interacts with various objects and non-player characters with the aim of collecting several gestures from the Portuguese Sign Language. This interaction is supported by data gloves and Kinect. These gestures can then be represented by the character. This allows the user to visualize and learn or train the various existing gestures. To improve the interactivity and to make the game more interesting and motivating, several checkpoints were placed along game levels. This will provide the players a chance to test the knowledge they have acquired so far on the checkpoints by performing the signs using Kinect. A High Scores system was also created as well as a history to ensure that the game is a continuous motivating process as well as a learning process

Virtual sign: using a bidirectional translator in serious games

The work presented in this paper is one of the outcomes of the virtual sign project that aims to assist the communication with deaf students in the classroom. The project is being developed by Portuguese researchers. The main goal of the virtual sign project is the creation of a bidirectional Portuguese sign language translator. This translator supports the development of a serious game that was developed to facilitate the sign language learning process. In the game, it is possible to gather different gestures and reproduce them. The game includes three different scenarios. These scenarios are linked to increasing levels of proficiency in sign language. The first one addresses the alphabet, the second one goes a step forward to teach words, and the third one introduces full sentences. The game experience can be enhanced by using the Kinect to perform the gestures. This game intends to be of great assistance in the process of learning the Portuguese sign language.This work was supported by Engineering Institute of Oporto and GILT (Graphics, Interaction and Learning Technologies) under Grant Nos. 60973089. FCT (Fundação para a ciência e Tecnologia) project.info:eu-repo/semantics/publishedVersio