Development of molecular tools for production and purification of recombinant proteins through real-time monitoring

Les besoins en protéines recombinantes dans les diverses activités des bio-industries a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, les procédés de leur production sont encore limités par le manque de marqueurs permettant de suivre l'expression et la purification des protéines d'intérêt, la formation des corps d'inclusion et les faibles degrés de pureté.Afin de pallier à ces difficultés, nous avons développé et mis en œuvre un nouveau procédé de production et de purification de protéines recombinantes chez Escherichia coli. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une cassette d'expression appelée Multitags et sur le clivage par une TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine. Le Multitags comporte, à partir de son extrémité N-terminale, un double tag d'affinité (10xHis et SBP), le domaine de fixation de l'hème du cytochrome b5 et le site de clivage de la TEV protéase. En utilisant deux modèles différents de protéine d'intérêt (MyRIP et la Pfu DNA polymérase), nous avons montré l'efficacité du cytochrome b5 dans le suivi visuel et quantitatif par mesure d'absorbance des différentes étapes de production et de purification. Nous avons obtenu plus de 90% de chacune des deux protéines de fusion dans la phase soluble. L'application d'une chromatographie double via les deux tags d'affinité 10xHis et SBP a permis d'atteindre un degré de pureté du Multitags-MyRIP et du Multitag-Pfu de 99%. Nous avons construit des colonnes protéolytiques en produisant la TEV protéase sauvage et sa version mutée (S219V) en fusion avec le Streptag II et en immobilisant ces enzymes par affinité sur colonne de streptavidine-agarose. La caractérisation des colonnes protéolytiques et leur application aux protéines recombinantes d'intérêt modèles ont montré l'avantage de cette méthode d'immobilisation en termes d'activité protéase retenue, de stabilité des enzymes, de leur réutilisation et de simplification du schéma de purification et de récupération des protéines d'intérêt à haut degré de pureté. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis de développer et de valider des outils innovants pour l'expression et la purification de protéines recombinantes.In recent years, the need for recombinant proteins has substantially increased in various bio-industry activities. However, actual recombinant processes are still limited by the lack of markers allowing real-time expression and purification monitoring of target proteins, by inclusion bodies formation and by low quality of purity of the products. To overcome these difficulties, we have developed a new process for production and purification of recombinant proteins in Escherichia coli. The method combines the use of a multifunctional expression cassette, termed Multitags and an immobilized modified TEV protease on a streptavidin matrix. The Multitags contains, its N-terminus, two affinity purification tags (10xHis and SBP) and as a marker tag, the heme-binding domain of cytochrome b5 followed by the TEV cleavage site. Using two model proteins (MyRIP and Pfu DNA polymerase), we have demonstrated the visual and the quantitative monitoring capability of the cytochrome b5 during the expression and purification steps. When expressed in E. coli KRX more than 90% of both fusion proteins were produced in a soluble form. In addition, high purity (99%) of Multitags-MyRIP and Multitags-Pfu was achieved after two consecutive affinity purification steps using the dual affinity tag. We also produced the wild-type and the S219V mutant TEV proteases fused to the Streptag II affinity sequence and realized their affinity immobilization on a streptavidin-agarose matrix. The characterization of the proteolytic columns and their application to the recombinant model proteins demonstrated the advantage of this immobilization method in terms of retaining activities, enzyme stabilities, possibility of reuse and simplification of the cleavage downstream steps.In conclusion, this study allowed the development and the validation of innovative tools for expression and purification of recombinant proteins

Développement d'outils moléculaires de production et de purification de protéines recombinantes par suivi en temps réel

Les besoins en protéines recombinantes dans les diverses activités des bio-industries a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, les procédés de leur production sont encore limités par le manque de marqueurs permettant de suivre l'expression et la purification des protéines d'intérêt, la formation des corps d'inclusion et les faibles degrés de pureté.Afin de pallier à ces difficultés, nous avons développé et mis en œuvre un nouveau procédé de production et de purification de protéines recombinantes chez Escherichia coli. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une cassette d'expression appelée Multitags et sur le clivage par une TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine. Le Multitags comporte, à partir de son extrémité N-terminale, un double tag d'affinité (10xHis et SBP), le domaine de fixation de l'hème du cytochrome b5 et le site de clivage de la TEV protéase. En utilisant deux modèles différents de protéine d'intérêt (MyRIP et la Pfu DNA polymérase), nous avons montré l'efficacité du cytochrome b5 dans le suivi visuel et quantitatif par mesure d'absorbance des différentes étapes de production et de purification. Nous avons obtenu plus de 90% de chacune des deux protéines de fusion dans la phase soluble. L'application d'une chromatographie double via les deux tags d'affinité 10xHis et SBP a permis d'atteindre un degré de pureté du Multitags-MyRIP et du Multitag-Pfu de 99%. Nous avons construit des colonnes protéolytiques en produisant la TEV protéase sauvage et sa version mutée (S219V) en fusion avec le Streptag II et en immobilisant ces enzymes par affinité sur colonne de streptavidine-agarose. La caractérisation des colonnes protéolytiques et leur application aux protéines recombinantes d'intérêt modèles ont montré l'avantage de cette méthode d'immobilisation en termes d'activité protéase retenue, de stabilité des enzymes, de leur réutilisation et de simplification du schéma de purification et de récupération des protéines d'intérêt à haut degré de pureté. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis de développer et de valider des outils innovants pour l'expression et la purification de protéines recombinantes.In recent years, the need for recombinant proteins has substantially increased in various bio-industry activities. However, actual recombinant processes are still limited by the lack of markers allowing real-time expression and purification monitoring of target proteins, by inclusion bodies formation and by low quality of purity of the products. To overcome these difficulties, we have developed a new process for production and purification of recombinant proteins in Escherichia coli. The method combines the use of a multifunctional expression cassette, termed Multitags and an immobilized modified TEV protease on a streptavidin matrix. The Multitags contains, its N-terminus, two affinity purification tags (10xHis and SBP) and as a marker tag, the heme-binding domain of cytochrome b5 followed by the TEV cleavage site. Using two model proteins (MyRIP and Pfu DNA polymerase), we have demonstrated the visual and the quantitative monitoring capability of the cytochrome b5 during the expression and purification steps. When expressed in E. coli KRX more than 90% of both fusion proteins were produced in a soluble form. In addition, high purity (99%) of Multitags-MyRIP and Multitags-Pfu was achieved after two consecutive affinity purification steps using the dual affinity tag. We also produced the wild-type and the S219V mutant TEV proteases fused to the Streptag II affinity sequence and realized their affinity immobilization on a streptavidin-agarose matrix. The characterization of the proteolytic columns and their application to the recombinant model proteins demonstrated the advantage of this immobilization method in terms of retaining activities, enzyme stabilities, possibility of reuse and simplification of the cleavage downstream steps.In conclusion, this study allowed the development and the validation of innovative tools for expression and purification of recombinant proteins.CERGY PONTOISE-Bib. electronique (951279901) / SudocSudocFranceF

WITHDRAWN: Reprint of: A new tagged-TEV protease: Construction, optimisation of production, purification and test activity

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An Improved Strategy for Easy Process Monitoring and Advanced Purification of Recombinant Proteins

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An Improved Strategy for Easy Process Monitoring and Advanced Purification of Recombinant Proteins

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A new tagged-TEV protease: Construction, optimisation of production, purification and test activity

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A simple gas pressure manometer for measuring hydrogen production by hydrogenogenic cultures in serum bottles

International audienceThis study investigated the determination of hydrogen production by three H2-producing microorganisms (Thermotoga maritima, Thermococcus kodakarensis KOD1 and Enterobacter cloacae) cultured in 116-mL serum bottles. A gas pressure manometer was used to measure total pressure in the serum-bottle headspace. It was demonstrated that total pressure is the sum of the saturation pressure of water, the pressure expansion of gases, and the partial pressures of H2 () and CO2 (). A linear relationship was established between the partial pressure of H2 measured by gas chromatography and the sum of the partial pressures of H2 and CO2 measured by the manometer. When pH of culture medium was not controlled (pH decreased from 7 to 5), the ratio was close to stoichiometric H2/CO2 yield ratio of the most plausible metabolic pathways of each strain. values were 1.7, 1.9 and 0.9 for T. maritima, T. kodakarensis and E. cloacae, respectively. In these experimental conditions, can be deduced from total pressure measured by manometer