Interactions de la protéine nsP1 du virus Chikungunya avec les membranes de l’hôte et conséquences fonctionnelles

Positive strand RNA ((+) RNA) viruses share the common capacity to rearrange cellular membranes into vesicular organelles. These membranous compartments referred to as replication organelles (ROs), are seen as providing an appropriate environment recruiting all viral components and cofactors required for replication. Because of their strict necessity for viral replication, these compartments and the molecular mechanisms required for their assembly have generated an intense interest in recent years. Contrasting with the consequential advances made in this field for other (+)RNA viruses, virtually no mechanistic data has been produced on the formation of ROs by Alphaviruses which in the last decade have proven to be medically paramount viruses, especially with the recent spread of Chikungunya virus (CHIKV). CHIKV is a re-emerging virus transmitted by mosquitoes that has caused outbreaks with devastating socio-economic impact in countries where it propagates. Symptoms include high fever and rash, with a significant percentage of patients suffering of long-term, often incapacitating, joint pain. Currently there is no vaccine or anti-viral treatment for this virus.CHIKV ROs appear as 50-60 nm electron translucent bulb-shaped spherules resulting from negative curvature at the plasma membrane. Inside these compartments, the replication machinery is anchored to the membrane through the direct interaction of the non-structural protein 1 (nsP1) with the lipid bilayer. When expressed as an isolated protein nsP1 dramatically remodels cellular membranes into filopodia-like protrusions. Therefore, this designated nsP1 as a critical factor in cellular membrane reshaping observed during infection. In this context, the aim of this thesis, with nsP1 at its centerpiece, is to characterize nsP1 interactions with cellular membranes and to define their functional consequences on viral replication. In this investigation, we have demonstrated the role of host cell lipid metabolism in nsP1 membrane anchoring and viral infection. Our results indicate that fatty acid synthesis is required for viral life cycle and favors nsP1 interaction with membranes. We also provide the very first information on the role of unsaturated fatty acids in Alphavirus replication. In-depth studies on the role of cholesterol revealed that palmitoylated nsP1 anchored CHIKV non-structural proteins to cholesterol-rich microdomains with functional consequences on replication. Finally, we have identified nsP1 interactome in order to identify host-cofactors required for the membrane deformation induced by this viral protein. Taken together, this thesis provides new information on nsP1/membrane lipids and host cofactors interplay. This work will allow the further comprehension of the mechanisms behind membrane deformation observed during Alphavirus replication.Les virus à ARN de polarité positive (ARN(+)) partagent la capacité de réorganiser les membranes cellulaires en organelles vésiculaires. Ces compartiments, appelés organelles de réplication (OR), fournissent un environnement approprié permettant d’héberger la machinerie de réplication virale, ses cofacteurs cellulaires et les ARN viraux néo-synthétisés. En raison de leur rôle indispensable à la réplication virale, ces compartiments et les mécanismes moléculaires nécessaires à leur assemblage ont suscité un réel intérêt ces dernières années. Alors que des progrès significatifs ont été réalisés dans ce domaine pour d’autres virus à ARN(+), peu de données relatives au mécanisme de formation des ORs des Alphavirus ont été produites. Ces virus ont pourtant été associés à des enjeux majeurs de santé publique au cours de la dernière décennie, en particulier avec la propagation récente du virus Chikungunya (CHIKV). CHIKV est en effet un virus réémergent transmis par les moustiques et à l’origine d’épidémies ayant des conséquences socio-économiques dévastatrices dans les pays où il se propage. Les symptômes se caractérisent par une forte fièvre et une éruption cutanée, avec un pourcentage significatif de patients qui souffrent de douleurs articulaires à long terme, souvent invalidantes. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral pour ce virus.Les OR de CHIKV se présentent comme des sphérules de 50 à 60 nm résultant d’une courbure négative de la membrane plasmique. À l’intérieur de ces compartiments, la machinerie de réplication est ancrée à la membrane par l’interaction directe de la protéine non structurale 1 (nsP1) avec la bicouche lipidique. Cette protéine virale, exprimée de façon isolée, conduit à des déformations membranaires de type filopodes. Ainsi, nsP1 apparait comme un acteur majeur du remodelage membranaire au cours de l’infection par les Alphavirus. Dans ce contexte, le but de cette thèse, centrée sur nsP1, est de caractériser les interactions de nsP1 avec les membranes cellulaires et de définir les conséquences fonctionnelles de ces interactions dans la réplication virale. Nous avons mis en évidence le rôle du métabolisme lipidique dans l’ancrage membranaire de nsP1 et dans l’infection virale. Nos résultats indiquent que la production d’acides gras est nécessaire au cycle infectieux et favorise l’interaction de nsP1 avec les membranes. Ils mettent en évidence le rôle complètement nouveau des acides gras insaturés dans l’étape de réplication des Alphavirus. Nous avons également démontré l’affinité de la forme palmitoylée de nsP1 pour les microdomaines lipidiques riches en cholestérol de la membrane plasmique. Nous avons établi les conséquences fonctionnelles de cette affinité sur la localisation des autres protéines non structurales et sur la réplication virale. Enfin, nous avons défini l’interactome fonctionnel de nsP1, de façon à identifier les cofacteurs cellulaires pouvant contribuer aux déformations membranaires induites par cette protéine virale. Ce travail permet de mieux comprendre les mécanismes de déformation membranaires observés au cours de l’infection par les Alphavirus

Interaction of Chikungunya virus nsP1 protein with cellular membranes and functional consequences

Les virus à ARN de polarité positive (ARN(+)) partagent la capacité de réorganiser les membranes cellulaires en organelles vésiculaires. Ces compartiments, appelés organelles de réplication (OR), fournissent un environnement approprié permettant d’héberger la machinerie de réplication virale, ses cofacteurs cellulaires et les ARN viraux néo-synthétisés. En raison de leur rôle indispensable à la réplication virale, ces compartiments et les mécanismes moléculaires nécessaires à leur assemblage ont suscité un réel intérêt ces dernières années. Alors que des progrès significatifs ont été réalisés dans ce domaine pour d’autres virus à ARN(+), peu de données relatives au mécanisme de formation des ORs des Alphavirus ont été produites. Ces virus ont pourtant été associés à des enjeux majeurs de santé publique au cours de la dernière décennie, en particulier avec la propagation récente du virus Chikungunya (CHIKV). CHIKV est en effet un virus réémergent transmis par les moustiques et à l’origine d’épidémies ayant des conséquences socio-économiques dévastatrices dans les pays où il se propage. Les symptômes se caractérisent par une forte fièvre et une éruption cutanée, avec un pourcentage significatif de patients qui souffrent de douleurs articulaires à long terme, souvent invalidantes. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral pour ce virus.Les OR de CHIKV se présentent comme des sphérules de 50 à 60 nm résultant d’une courbure négative de la membrane plasmique. À l’intérieur de ces compartiments, la machinerie de réplication est ancrée à la membrane par l’interaction directe de la protéine non structurale 1 (nsP1) avec la bicouche lipidique. Cette protéine virale, exprimée de façon isolée, conduit à des déformations membranaires de type filopodes. Ainsi, nsP1 apparait comme un acteur majeur du remodelage membranaire au cours de l’infection par les Alphavirus. Dans ce contexte, le but de cette thèse, centrée sur nsP1, est de caractériser les interactions de nsP1 avec les membranes cellulaires et de définir les conséquences fonctionnelles de ces interactions dans la réplication virale. Nous avons mis en évidence le rôle du métabolisme lipidique dans l’ancrage membranaire de nsP1 et dans l’infection virale. Nos résultats indiquent que la production d’acides gras est nécessaire au cycle infectieux et favorise l’interaction de nsP1 avec les membranes. Ils mettent en évidence le rôle complètement nouveau des acides gras insaturés dans l’étape de réplication des Alphavirus. Nous avons également démontré l’affinité de la forme palmitoylée de nsP1 pour les microdomaines lipidiques riches en cholestérol de la membrane plasmique. Nous avons établi les conséquences fonctionnelles de cette affinité sur la localisation des autres protéines non structurales et sur la réplication virale. Enfin, nous avons défini l’interactome fonctionnel de nsP1, de façon à identifier les cofacteurs cellulaires pouvant contribuer aux déformations membranaires induites par cette protéine virale. Ce travail permet de mieux comprendre les mécanismes de déformation membranaires observés au cours de l’infection par les Alphavirus.Positive strand RNA ((+) RNA) viruses share the common capacity to rearrange cellular membranes into vesicular organelles. These membranous compartments referred to as replication organelles (ROs), are seen as providing an appropriate environment recruiting all viral components and cofactors required for replication. Because of their strict necessity for viral replication, these compartments and the molecular mechanisms required for their assembly have generated an intense interest in recent years. Contrasting with the consequential advances made in this field for other (+)RNA viruses, virtually no mechanistic data has been produced on the formation of ROs by Alphaviruses which in the last decade have proven to be medically paramount viruses, especially with the recent spread of Chikungunya virus (CHIKV). CHIKV is a re-emerging virus transmitted by mosquitoes that has caused outbreaks with devastating socio-economic impact in countries where it propagates. Symptoms include high fever and rash, with a significant percentage of patients suffering of long-term, often incapacitating, joint pain. Currently there is no vaccine or anti-viral treatment for this virus.CHIKV ROs appear as 50-60 nm electron translucent bulb-shaped spherules resulting from negative curvature at the plasma membrane. Inside these compartments, the replication machinery is anchored to the membrane through the direct interaction of the non-structural protein 1 (nsP1) with the lipid bilayer. When expressed as an isolated protein nsP1 dramatically remodels cellular membranes into filopodia-like protrusions. Therefore, this designated nsP1 as a critical factor in cellular membrane reshaping observed during infection. In this context, the aim of this thesis, with nsP1 at its centerpiece, is to characterize nsP1 interactions with cellular membranes and to define their functional consequences on viral replication. In this investigation, we have demonstrated the role of host cell lipid metabolism in nsP1 membrane anchoring and viral infection. Our results indicate that fatty acid synthesis is required for viral life cycle and favors nsP1 interaction with membranes. We also provide the very first information on the role of unsaturated fatty acids in Alphavirus replication. In-depth studies on the role of cholesterol revealed that palmitoylated nsP1 anchored CHIKV non-structural proteins to cholesterol-rich microdomains with functional consequences on replication. Finally, we have identified nsP1 interactome in order to identify host-cofactors required for the membrane deformation induced by this viral protein. Taken together, this thesis provides new information on nsP1/membrane lipids and host cofactors interplay. This work will allow the further comprehension of the mechanisms behind membrane deformation observed during Alphavirus replication

Post-lockdown detection of SARS-CoV-2 RNA in the wastewater of Montpellier, France

International audienceThe evolution of the COVID-19 pandemic can be monitored through the detection of SARS-CoV-2 RNA in sewage. Here, we measured the amount of SARS-CoV-2 RNA at the inflow point of the main waste water treatment plant (WWTP) of Montpellier, France. We collected samples 4 days before the end of lockdown and up to 70 days post-lockdown. We detected increased amounts of SARS-CoV-2 RNA at the WWTP from mid-June on, whereas the number of new COVID-19 cases in the area started increasing a couple of weeks later. Future epidemiologic investigations shall explain such asynchronous finding

Fatty acid synthase and stearoyl-CoA desaturase-1 are conserved druggable cofactors of Old World Alphavirus genome replication

International audienc

PTPN13 induces cell junction stabilization and inhibits mammary tumor invasiveness

International audienceClinical data suggest that the protein tyrosine phosphatase PTPN13 exerts an anti-oncogenic effect. Its exact role in tumorigenesis remains, however, unclear due to its negative impact on FAS receptor-induced apoptosis. Methods: We crossed transgenic mice deleted for PTPN13 phosphatase activity with mice that overexpress human HER2 to assess the exact role of PTPN13 in tumor development and aggressiveness. To determine the molecular mechanism underlying the PTPN13 tumor suppressor activity we developed isogenic clones of the aggressive human breast cancer cell line MDA-MB-231 overexpressing either wild type or a catalytically-inactive mutant PTPN13 and subjected these to phosphoproteomic and gene ontology analyses. We investigated the PTPN13 consequences on cell aggressiveness using wound healing and Boyden chamber assays, on intercellular adhesion using videomicroscopy, cell aggregation assay and immunofluorescence. Results: The development, growth and invasiveness of breast tumors were strongly increased by deletion of the PTPN13 phosphatase activity in transgenic mice. We observed that PTPN13 phosphatase activity is required to inhibit cell motility and invasion in the MDA-MB-231 cell line overexpressing PTPN13. In vivo, the negative PTPN13 effect on tumor invasiveness was associated with a mesenchymal-to-epithelial transition phenotype in athymic mice xenografted with PTPN13-overexpressing MDA-MB-231 cells, as well as in HER2-overexpressing mice with wild type PTPN13, compared to HER2-overexpressing mice that lack PTPN13 phosphatase activity. Phosphoproteomic and gene ontology analyses indicated a role of PTPN13 in the regulation of intercellular junction-related proteins. Finally, protein localization studies in MDA-MB-231 cells and HER2-overexpressing mice tumors confirmed that PTPN13 stabilizes intercellular adhesion and promotes desmosome formation. Conclusions: These data provide the first evidence for the negative role of PTPN13 in breast tumor invasiveness and highlight its involvement in cell junction stabilization