Farinha do caroço de abacate como substrato alternativo para produção de pectinases por Gongronella butleri

The use of leftovers or refuse from agricultural and/or agro-industrial production for the cultivation of microorganisms with enzyme production has become constant, as well as being suitable as a sustainable alternative; adds value to by-products; and also acts as a mitigation strategy for environmental changes. The present work aimed to study the profile of the bioconversion activity of avocado kernel flour, carried out by the fungal strain Gongronella butleri, in order to produce pectinases. The fungal strain was inoculated in triplicate, in flasks containing freeze-dried avocado seed meal, which were previously moistened with nutrient saline solution and sterilized. Fermentations took place at 35ºC for 24, 48, 72, 96 and 120 h. The production profile of pectinases over time was determined by measuring the enzymatic activity (U g-1) of the crude extract obtained in the fermentations, using spectrophotometry at 540 nm, according to the standard method of reduction of 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS). The avocado kernel flour induced the production of enzymes, with an increase in pectinolytic activity with the course of fermentation, reaching the peak of highest activity (19.43 U g-1) at 96 h. In comparison with studies that used microbial genera considered standard for the fermentation of agro-industrial "waste" and the production of pectinases, the fungal strain of G. butleri, presents itself as a potential alternative biological agent in the production of pectinases, when compared to stone flour from avocado, especially if optimization tests are applied.O emprego das sobras ou refugos da produção agrícola e/ou agroindustrial, para o cultivo de micro-organismos com produção de enzimas tem se tornado constante, pois além de adequar-se como uma alternativa sustentável; agrega valor aos subprodutos; e ainda atua como uma estratégia de mitigação das alterações ambientais. O presente trabalho objetivou estudar o perfil da atividade de bioconversão da farinha do caroço de abacate, realizada pela cepa fúngica Gongronella butleri, visando-se produzir pectinases. A cepa fúngica foi inoculada em triplicata, em frascos contento farinha de caroço de abacate liofilizada, sendo estes previamente umidificados com solução salina nutriente e esterilizados. As fermentações ocorreram a 35ºC por 24, 48, 72, 96 e 120 h. O perfil de produção de pectinases ao longo do tempo foi determinado pela mensuração da atividade enzimática (U g-1) do extrato bruto obtido nas fermentações, por meio de espectrofotometria a 540 nm, conforme método padrão de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico (DNS). A farinha do caroço de abacate induziu a produção de enzimas, sendo observado aumento da atividade pectinolítica com o decorrer do tempo de fermentação, atingindo-se o pico de maior atividade (19,43 U g-1) a 96 h. Em comparação com estudos que empregaram gêneros microbianos considerados padrão para fermentação de “resíduos” agroindustriais e produção de pectinases, a cepa fúngica de G. butleri, apresenta-se como potencial agente biológico alternativo na produção de pectinases, quando frente a farinha do caroço de abacate, especialmente se testes de otimização forem aplicados

Esterase profile in the postembryonic development of Rhipicephalus microplus

O objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de atividade da esterase nos estágios de desenvolvimento de Rhipicephalus microplus por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, com uso de coloração específica para esterase. Observou-se a presença de nove regiões com atividade esterásica, coradas tanto pelo alfa-naftil acetato como pelo beta-naftil acetato, e definidas como alfa-beta-esterases. Foram detectadas esterases estágio-específicas, e os estágios de ninfa de primeiro estádio e de larva foram os que mostraram maior atividade esterásica durante todo o desenvolvimento. A esterase EST-4 foi detectada apenas em machos e considerada sexo-específica. Existem diferenças quanto ao perfil esterásico nos diferentes estágios de desenvolvimento pós-embrionário de R. microplus.The objective of this work was to analyze the pattern of esterase activity in the development stages of Rhipicephalus microplus by nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis using specific staining for esterase. The electrophoretical results revealed the presence of nine regions displaying esterase activity, stained with both alpha-naphthyl acetate and beta-naphthyl acetate, and classified as alpha-beta-esterase. Stage-specific esterases were found, with the first nymphal and larval stages showing the greatest esterase activity throughout the development. An esterase called EST-4 was detected only in males and was considered sex-specific. There are differences in the esterase profile among the different postembryonic development stages of R. microplus

Esterases e resistência a acaricidas no carrapato bovino Boophilus microplus (Acari, Ixodidae)

The cattle tick Boophilus microplus is one of the most important ectoparasites for the Brazilian farming, and it is responsible, according to Agriculture Ministry, for direct and indirect damages to livestock of, approximately, two billions dollars a year. The traditional method of control is based on the intensive use of pyrethroids and organophosphate pesticides, whose systematic use has been promoting the selection of resistant genotypes in tick populations. Point mutations in esterase genes and the increase of production of these enzymes represent important strategies of resistance, conferring insensivity to neurotoxic effects of these organic compounds in this specie. In this work, esterase patterns were compared among the stages of the life cycle of B. microplus, in non-denaturing polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE), using specific staining for esterases. Electrophoretical results indicate the presence of nine regions displaying esterase activity. These esterases were considered as products from nine alleles distributed in seven gene loci. Esterases that were detected in all the stages of development were considered as products of housekeeping genes. Some stage-specific and sex-specific esterases were also detected. Strains with different levels of resistance were selected after the resistance test with the malation organophosphate and with the deltametrin pyrethroid in engorged females from a farm of Uberlândia region (MG), with description of resistance. Electrophoretical profiles of esterase pattern using non-denaturing polyacrilamide gel electrophoresis among malathion and deltametrin-susceptible, tolerant and resistant tick strains revealed four bands displaying esterase activity, named EST-1 to EST-4. The esterases EST-3 and EST-4, classified as carboxylesterases, were observed in all strains. The esterase EST-2, classified as an acetylcholinesterase in inhibitor tests, was detected in all strains, but it has presented an increasing degree of staining, from susceptible to resistant strains, indicating an increase in the enzyme production according to resistance level, probably as a result of gene amplification or post-traditional alterations. The enzyme EST-1, classified as an acetylcholinesterase, was detected exclusively in tolerant and resistant strains to both acaricides, however, with higher activity in resistant strains. These data indicate that the detected acetylcholinesterases could xviii be representing important detoxification strategy developed to overcome the effects of the acaricides. These strains were also analyzed by the techniques Low Ionic Strength Single Stranded Conformation Polymorphism (LIS-SSCP) and Polimerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCRRFLP) to investigate mutations in a putative carboxylesterase fragment. The digestion of the amplified fragment of 372bp with the restriction enzyme Eco RI showed three band patterns, associated to three distinct genotypes: W, H and M, which were observed in different frequencies in the analyzed strains. The homozygous wild genotype (W) was detected only in the susceptible strains, in high frequency. The heterozygous genotype (H) was observed in all strains, however, in higher frequency in tolerant strains, and the homozygous mutant genotype (M) was observed only in the resistant and tolerant strains, with higher frequency in the resistant strains, suggesting that the resistance can be associated to the presence of the m mutant allele (EcoRI polymorphism). The genotyping by LIS-SSCP showed four haplotypes, named 1, 2, 3 and 4. The haplotype 1 was observed only in the susceptible strains and in high frequency. The haplotype 4 was observed in the resistant and tolerant strains with higher frequency in tolerant strains. The haplotype 3 was observed in resistant and tolerant strains, and was detected in higher frequency in the resistant strains. The haplotype 2, was also detected in resistant and tolerant strains, however, in very low frequency in population. The comparison among the sequences demonstrated the presence of mutations, beyond the EcoRI polymorphism in resistant and tolerant strains. The presence of stop codons was also observed, creating truncated proteins in the susceptible and tolerant strains. The domains analysis showed additional motifs in resistant strain. The obtained data suggest mechanisms mediated by point mutations, gene amplification and post-traditional modifications, which can be altering the activity of the translated proteins and acting together in the expression of resistance in the analyzed population.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorDoutor em Genética e BioquímicaO carrapato bovino Boophilus microplus é um dos ectoparasitos mais importantes para a agropecuária brasileira, sendo responsável, segundo o Ministério da Agricultura, por prejuízos diretos e indiretos à bovinocultura de, aproximadamente, dois bilhões de dólares ao ano. O método tradicional de controle baseia-se no uso de acaricidas piretróides e organofosforados, cujo uso sistemático tem promovido a seleção de genótipos resistentes em populações de carrapatos. Mutações de ponto em genes codificadores de esterases e o aumento na produção dessas enzimas representam importantes estratégias de resistência, conferindo insensibilidade ao efeito neurotóxico desses compostos orgânicos nessa espécie. Neste trabalho, realizou-se a análise do padrão de esterases nas diferentes fases do ciclo de vida do carrapato, por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo e coloração específica para esterases. Os resultados mostraram nove regiões com atividade esterásica, consideradas como produtos de nove alelos distribuídos em sete loci genéticos. Esterases detectadas em todas as fases do desenvolvimento foram consideradas como produtos de genes housekeeping. Esterases estágioespecíficas e sexo-específicas foram, também, detectadas. Linhagens com diferentes níveis de resistência foram selecionadas após o teste de resistência com o organofosforado malation e o piretróide deltametrina em teleóginas provenientes de uma fazenda da região de Uberlândia, MG, com histórico de resistência. A análise do padrão de esterases por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante das linhagens sensível (SM), tolerante (TM) e resistente (RM) ao malation e das linhagens sensível (SD), tolerante (TD) e resistente (RD) a deltametrina revelou a presença de quatro regiões com atividade esterásica (EST-1 a EST-4). As enzimas EST-3 e EST-4, classificadas como carboxilesterases (CaEs), foram observadas em todas as linhagens. A EST- 2, classificada como acetilcolinesterase (AChE), foi detectada em todas as linhagens, porém, apresentou intensidade crescente de atividade esterásica, indicando aumento na produção da enzima de acordo com o nível de resistência, provavelmente resultante de amplificação gênica ou alterações pós-traducionais. A EST-1, classificada como AChE, foi detectada exclusivamente nas linhagens tolerantes e resistentes a ambos acaricidas, com maior atividade nas linhagens xvi resistentes (RD e RM). Os resultados indicam que as AChEs detectadas representam importante estratégia de detoxificação aos acaricidas. Essas linhagens foram, também, analisadas pelas técnicas Low Ionic Strength Single Stranded Conformation Polymorphism (LIS-SSCP) e Polimerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) para investigação de mutações em uma provável CaE. A digestão do fragmento amplificado de 372pb com enzima de restrição Eco RI por PCR-RFLP mostrou três padrões de bandas associados a três genótipos distintos, W, H e M, observados em diferentes freqüências nas linhagens analisadas. O genótipo homozigoto selvagem (W) foi detectado exclusivamente nas linhagens sensíveis (SD e SM) e em alta freqüência. O genótipo heterozigoto (H) foi detectado em todas as linhagens, porém, em maior freqüência nas linhagens tolerantes (TD e TM) e, o genótipo homozigoto mutante (M) foi observado nas linhagens tolerantes e resistentes, em maior freqüência nas linhagens resistentes (RD e RM), sugerindo que a resistência esteja associada à presença do alelo mutante m (polimorfismo EcoRI). A genotipagem por LIS-SSCP mostrou quatro haplótipos: 1 2, 3 e 4. O haplótipo 1 foi observado apenas nas linhagens sensíveis (SD e SM) e em alta freqüência. O haplótipo 4 foi observado nas linhagens tolerantes e resistentes, com a maior freqüência nas linhagens tolerantes (TD e TM). O haplótipo 3, foi observado nas linhagens tolerantes e resistentes, sendo detectado em maior freqüência nas linhagens resistentes (RD e RM). O haplótipo 2 foi detectado nas linhagens tolerantes e resistentes, porém, em freqüência muito baixa. A comparação entre as seqüências revelou a presença de mutações de ponto, além do polimorfismo EcoRI nas linhagens tolerante e resistente ao malation. Foi observada, também, a presença de códons de parada, gerando proteínas truncadas, nas linhagens sensível e tolerante. A análise de domínios mostrou a presença de domínios adicionais na linhagem resistente. Os dados obtidos sugerem a existência de mecanismos mediados por mutações de ponto, amplificação gênica e modificações pós-traducionais, que podem estar alterando a atividade das proteínas traduzidas e atuando em conjunto na expressão da resistência na população analisada

Qualidade microbiológica do leite cru in natura, leite cru refrigerado e leite pasteurizado comercializados na região de Uberlândia, MG

Neste trabalho investigou-se a qualidade microbiológica do leite proveniente de três diferentes fornecedores (duas propriedades rurais e um laticínio de Uberlândia-MG). Foram realizadas estimativas do número de bactérias aeróbias mesófilas por Contagem Padrão em Placas (CPP) em meio PCA (Agar Padrão para Contagem) a 30 oC e do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais em Caldo Lactosado (Teste Presuntivo) a 35 oC por 48 h. Após esse período, as amostras positivas (turbidez no meio e produção de gás) foram inoculadas em Caldo Verde Bile Brilhante (VBB, Teste Confirmativo) a 35 oC por 48 h e em Caldo EC a 45 oC por 24 h (Teste Completo) para estimar o NMP de coliformes totais e termotolerantes, respectivamente. Os valores médios de mesófilos encontrados nas amostras dos fornecedores A, B e C foram: 1,28 x 108; 2,45 x 106 e 0 (zero) Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC mL-1), respectivamente. Para coliformes totais, os valores médios foram: >2400, >100 e 0 (zero) NMP mL-1, e, para coliformes termotolerantes foram 1100, 7 e 0 (zero) NMP mL-1, respectivamente. Os resultados demonstraram que nas duas propriedades os valores foram acima dos permitidos por lei, reforçando a relevância dos cuidados com as condições higiênico-sanitárias do local. O presente estudo também mostrou a importância do processo de pasteurização para assegurar a qualidade microbiológica do leite

Invertase from a Candida stellata strain isolated from grape: production and physico-chemical characterization

Invertases are enzymes which hydrolyze the sucrose and are widely employed in food and pharmaceutical industries. In this work, the screening of autochthonous grape yeasts from Brazil was carried out in order to investigate their invertase production potential. Yeasts belonging to Saccharomyces, Hanseniaspora, Sporidiobolus, Issatchenkia, Candida, Cryptococcus and Pichia genera were analyzed by submerged fermentation (SbmF) using sucrose as substrate. Among them, Candida stellata strain (N5 strain) was selected as the best producer (10.6 U/ml after 48 hours of SbmF). This invertase showed optimal activity at pH 3.0 and 55°C, demonstrating appropriate characters for application in several industrial processes, which includes high temperatures and acid pHs. In addition, this invertase extract presented tolerance to low concentrations of ethanol, suggesting that it could also be suitable for application at the beginning of alcoholic fermentation. These data provide promising prospects of the use of this new invertase in food and ethanol industry

Yeast diversity isolated from grape musts during spontaneous fermentation from a brazilian winery

Saccharomyces and non-Saccharomyces yeast species from a winery located in Brazil were identified by ribosomal gene-sequencing analysis. A total of 130 yeast strains were isolated from grape surfaces and musts during alcoholic fermentation from Isabel, Bordeaux, and Cabernet Sauvignon varieties. Samples were submitted to PCR-RFLP analysis and genomic sequencing. Thirteen species were identified: Candida quercitrusa, Candida stellata, Cryptococcus flavescens, Cryptococcus laurentii, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Issatchenkia terricola, Pichia kluyveri, Pichia guilliermondii, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, and Sporidiobolus pararoseus. A sequential substitution of species during the different stages of fermentation, with a dominance of non-Saccharomyces yeasts at the beginning, and a successive replacement of species by S. cerevisiae strains at the final steps were observed. This is the first report about the yeast distribution present throughout the alcoholic fermentation in a Brazilian winery, providing supportive information for future studies on their contribution to wine quality. © 2013 Springer Science+Business Media New York

Yeast biodiversity from oleic ecosystems: Study of their biotechnological properties

The aim of this study was to know the yeast biodiversity from fresh olive (Olea europaea L.) fruits, olive paste (crush olives) and olive pomace (solid waste) from Arbequina and Cornicabra varieties. Yeasts were isolated from fruits randomly harvested at various olive groves in the region of Castilla La Mancha (Spain). Olive paste and pomace, a byproduct of the processing of this raw material, were also collected in sterile flasks from different oil mills. Molecular identification methodology used included comparison of polymerase chain reaction (PCR) amplicons of their 5.8S rRNA gene and internal transcribed spacers ITS1 and ITS2 followed by restriction pattern analysis (RFLP). For some species, sequence analysis of the 5.8S rDNA gene was necessary. The results were compared to sequences held in public databases (BLAST). These techniques allowed to identify fourteen different species of yeasts, belonging to seven different genera (Zygosaccharomyces, Pichia, Lachancea, Kluyveromyces, Saccharomyces, Candida, Torulaspora) from the 108 yeast isolates. Species diversity was thus considerable: Pichia caribbica, Zygosaccharomyces fermentati (Lachancea fermentati) and Pichia holstii (Nakazawaea holstii) were the most commonly isolated species, followed by Pichia mississippiensis, Lachancea sp., Kluyveromyces thermotolerans and Saccharomyces rosinii. The biotechnological properties of these isolates, was also studied. For this purpose, the activity of various enzymes (beta-glucosidase, beta-glucanase, carboxymethylcellulase, polygalacturonase, peroxidase and lipase) was evaluated. It was important that none of species showed lipase activity, a few had cellulase and polygalacturonase activities and the majority of them presented beta-glucanase, beta-glucosidase and peroxidase activities. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved

Esterase profile in the postembryonic development of Rhipicephalusmicroplus

O objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de atividade da esterase nos estágios de desenvolvimento de Rhipicephalus microplus por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, com uso de coloração específica para esterase. Observou-se a presença de nove regiões com atividade esterásica, coradas tanto pelo alfa-naftil acetato como pelo beta-naftil acetato, e definidas como alfa-beta-esterases. Foram detectadas esterases estágio-específicas, e os estágios de ninfa de primeiro estádio e de larva foram os que mostraram maior atividade esterásica durante todo o desenvolvimento. A esterase EST-4 foi detectada apenas em machos e considerada sexo-específica. Existem diferenças quanto ao perfil esterásico nos diferentes estágios de desenvolvimento pós-embrionário de R. microplus.The objective of this work was to analyze the pattern of esterase activity in the development stages of Rhipicephalus microplus by nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis using specific staining for esterase. The electrophoretical results revealed the presence of nine regions displaying esterase activity, stained with both alpha-naphthyl acetate and beta-naphthyl acetate, and classified as alpha-beta-esterase. Stage-specific esterases were found, with the first nymphal and larval stages showing the greatest esterase activity throughout the development. An esterase called EST-4 was detected only in males and was considered sex-specific. There are differences in the esterase profile among the different postembryonic development stages of R. microplus.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES

Lignocellulose-degrading enzymes production by solid-state fermentation through fungal consortium among Ascomycetes and Basidiomycetes.

In this study, five fungal strains (Aspergillus niger SCBM1 ? Ni, Aspergillus fumigatus SCBM6 ? Fu, Trametes versicolor 561 ? Tr, Ganoderma lucidum 601 ? Ga and Pleurotus ostreatus PL06 ? Pl) were cultivated individually and in consortium for biosynthesis of lignocellulose-degrading enzymes by solid-state fermentation (SSF). The enzyme production was investigated using a 25?1 fractional factorial design, with a total of 16 experiments (F1?F16) using raw sugarcane bagasse and raw wheat bran as substrates. Among the enzymatic extracts produced, Ni (F1) exhibited the highest production of endoglucanase (82.70 U/gds) (units per gram of dry substrate), exoglucanase (80.48 U/gds), ?-xylosidase (145.01 U/gds) and manganese peroxidase (3.38 U/gds). For filter paper cellulase, Tr cocktail (F5) was the one that stood out (9.45 U/gds). Among the extracts produced in consortium, Ni + Tr + Pl (F6) presented the highest production of ?-glucosidase (171.09 U/gds), ?-xylosidase (139.99 U/gds) and manganese peroxidase (3.29 U/gds). For FPase, Ni + Fu + Ga (F12) exhibited the best production (10.46 U/gds). The highest xylanase biosynthesis (2582.38 U/gds) was obtained in Ni + Fu + Pl extract (F4). For laccase, the maximum biosynthesis (25.27 U/gds) was obtained in Tr + Ga + Pl (F13). The cocktails that presented the best enzyme production were: Ni (F1), Ni + Fu + Pl (F9), Ni + Tr + Pl (F6) and Ni + Ga + Pl (F10), demonstrating that the use of microbial consortium can be a promising alternative to obtain enzymatic cocktails with high synergism